藏药匙叶翼首草中齐墩果酸及熊果酸的含量测定△

权红，甄梓娟，李连强，陈敏，兰小中*

(1.西藏大学 农牧学院 药用植物研究中心，西藏 林芝 860000；2.西南大学 药学院，重庆 400715)

·基础研究·

藏药匙叶翼首草中齐墩果酸及熊果酸的含量测定△

权红1，甄梓娟1，李连强1，陈敏2，兰小中1*

(1.西藏大学 农牧学院 药用植物研究中心，西藏 林芝 860000；2.西南大学 药学院，重庆 400715)

目的：采用HPLC-PDA法测定藏药匙叶翼首草不同生长年限、不同药用部位中的齐墩果酸及熊果酸含量动态变化。方法：采用YMC-ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%乙酸铵为流动相(85∶15)等度洗脱，流速为1 mL·min-1，检测波长为210 nm，柱温为35 ℃。结果：齐墩果酸在5～150 mg·L-1线性关系良好(r=0.999 5)，平均加样回收率为101.17%；熊果酸在20～600 mg·L-1线性关系良好(r=0.999 5)，平均加样回收率为100.69%。匙叶翼首草中齐墩果酸和熊果酸的质量分数分别为0.199～0.946、0.737～6.750 mg·g-1。结论：匙叶翼首草中齐墩果酸及熊果酸的含量在时间与空间格局上均具有统计学差异。

匙叶翼首草；齐墩果酸；熊果酸；含量测定

翼首草为川续断科(Dipsacaceae)翼首草属(Pterocephalus)匙叶翼首草Pterocephalushookeri(C.B.Clarke) Höeck植物的干燥全草，收载于《中华人民共和国药典》(《中国药典》)2015版一部[1]，是我国传统藏药材。具有解毒除瘟、清热止痢、祛风通痹的功效，主要用于治疗各种传染病所引起的热症、流行性感冒、感冒发烧，心热、血热、肠炎、关节炎等病症。在民间广泛应用，被喻为地上“七种仙草”之一[2]。其化学成分主要有三萜皂苷、环烯醚萜、木脂素、脂肪酸及多糖等成分[3-7]，其中三萜皂苷类及环烯醚萜类化合物是匙叶翼首草的主要活性成分，具有抗炎、护肝、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化以及机体免疫调节等作用[8]。《中国药典》2015版对匙叶翼首草中齐墩果酸及熊果酸总量进行了定量控制，规定干燥全草中齐墩果酸及熊果酸的总含量不低于0.20%。齐墩果酸及熊果酸为三萜类化合物，其结构式如图1所示。本实验采用HPLC-PDA测定匙叶翼首草不同生长年限、不同药用部位中的齐墩果酸及熊果酸含量，为翼首草的质量控制提供参考。

注：1.齐墩果酸；2.熊果酸。图1 齐墩果酸、熊果酸的化学结构

1 仪器与材料

岛津LC-20AD高效液相色谱仪(LC-20AD四元泵，DGU-20A脱气机，SPO-M20A二极管阵列检测器，SIL-20A自动进样器，CTO-20A柱温箱，日本岛津公司)；JP-020超声清洗器(100 W，40 kHz，深圳市洁盟清洗设备有限公司)；AB135-S电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；超纯水制备仪。

对照品：齐墩果酸(批号：J0709AS)、熊果酸(批号：N0827AS)购自大连美仑生物技术有限公司。色谱级甲醇(Sigma公司)，超纯水，其余试剂为分析纯。

9份翼首草药材采集自西藏林芝市巴宜区章麦村藏药材种植基地，经西藏大学农牧学院兰小中教授鉴定为川续断科植物匙叶翼首草的干燥全草。标本保存于西藏大学农牧学院食品科学学院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

YMC-ODSC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.1%乙酸铵水溶液(85∶15)等度洗脱，流速：1 mL·min-1，柱温：35 ℃，检测波长：210 nm，进样量：10 μL。在此条件下，齐墩果酸和熊果酸保留时间分别为19.948、20.943 min，两个成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，对照品和样品色谱图见图1。

注：A.混合对照品；B.供试品；1.齐墩果酸；2.熊果酸。图2 翼首草及混合对照品HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸、熊果酸适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成齐墩果酸质量浓度为0.2 mg·mL-1、熊果酸质量浓度为0.8 mg·mL-1的对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末(过三号筛)约2 g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率100 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，用少量甲醇洗涤滤渣及滤器，合并滤液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2项下的混合对照品溶液适量，置2 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，依次配成齐墩果酸质量浓度为150、125、100、75、50、25、10、5 mg·L-1，熊果酸质量浓度为600、500、400、300、200、100、40、20 mg·L-1的溶液。分别吸取上述系列混合对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，分别以齐墩果酸和熊果酸质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，结果见表1。

表1 齐墩果酸、熊果酸的线性关系

2.5 精密度试验

精密吸取供试品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件进样检测，连续进样6次，齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为1.2%、1.7%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品(3年生地下部分)溶液10 μL，分别于0、1、4、8、12、24 h按2.1项下色谱条件进样分析，测定齐墩果酸和熊果酸的峰面积，其RSD分别为1.4%、1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取6份同一翼首草粉末(3年生地下部分)2 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下进样检测分析，齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为1.9%、1.7%，表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的翼首草粉末(3年生地下部分)0.5 g，精密称定，共9份。精密称取齐墩果酸对照品1.4 mg、熊果酸4.24 mg置10 mL量瓶中，加适量甲醇溶解至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。根据样品中齐墩果酸含量的90%、100%、110%，分别加入齐墩果酸和熊果酸对照品共3份，按2.3方法制备成供试品溶液，进行HPLC分析，计算回收率，结果见表2。

表2 翼首草中齐墩果酸、熊果酸的加样回收率试验

2.9 样品测定

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按2.1色谱条件进行测定，计算各样品中齐墩果酸及熊果酸的质量分数，结果见表3、图3。

表3 翼首草样品中熊果酸和齐墩果酸的测定 /mg·g-1

图3 匙叶翼首草不同生长年限、不同药用部位的齐墩果酸、熊果酸含量变化

如图3所示，与1年生翼首草地下部分相比，2年和3年生地下部分中齐墩果酸及熊果酸含量均降低；与2年生翼首草地下部分相比，3年生齐墩果酸及熊果酸含量虽然有所提高，但增长幅度明显变小，基本趋于稳定，这表明翼首草根中的齐墩果酸及熊果酸含量在2年后的增加或减少的幅度很小。与1年生翼首草地上部分及全草相比，2年和3年生翼首草中齐墩果酸及熊果酸含量均升高。

3 讨论

实验结果表明，匙叶翼首草中的齐墩果酸及熊果酸含量在时间和空间格局上均具有统计学差异。在1～3年栽培年限内，地上部分及全草中齐墩果酸及熊果酸的含量显著增加，但地下部分齐墩果酸及熊果酸的含量有先降低后增加的趋势，其中齐墩果酸含量变化与已有文献报道的结果相一致，但熊果酸含量变化与之前的文献报道不相符[9]，可能是环境变化产生的影响。在人工栽培技术中，播种后第二年即可收获，第三年收获效果更佳[10-13]，从本实验的数据来看，是有一定科学依据的。在对匙叶翼首草不同药用部位中齐墩果酸及熊果酸含量测定发现，地上部分含量高于地下部分，1年生、2年生、3年生翼首草地上部分的齐墩果酸及熊果酸总量与地下部分的比值分别为2.8、6.7、6.8，栽培年限大于2年的翼首草地上部分总含量与地下部分趋于稳定，考虑其经济效益及种植成本，建议种植2～3年后采收。本实验测得的翼首草全草及地上部分齐墩果酸和熊果酸总含量均高于《中国药典》2015版标准，地下部分总含量均达不到该标准。

由于本文只考察了西藏林芝产翼首草药材不同生长年限的差别，未对其他产地翼首草药材进行考察，因此还有待于后续进一步研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：381.

[2] 庞伟.藏药翼首草的研究与应用[J].中国民族医药杂志，2007(5)：63-65.

[3] Tian J，Wu F E，Qiu M H，et al.Triterpenoid saponins fromPterocephalushookeri[J].Phytochemistry，1993，32(6)：1535-1538.

[4] 田军，吴凤锷，丘明华，等.匙叶翼首花的化学成分[J].天然产物研究与开发，2000，12(1)：35-38.

[5] Wu Y C，Guo C X，Zhu Y Z，et al.Four new bis-iridoids isolated from the traditional Tibetan herbPterocephalushookeri[J].Fitoterapia，2014，98：104-109.

[6] Wu Y C，Yin Y J，Li Y M，et al.Secoiridoid/iridoid subtype bis-iridoids fromPterocephalushookeri[J].MRC，2014，52(11)：734-738.

[7] Wu Y C，Ying Y J，Guo F J，et al.Bis-iridoid and lignans from traditional Tibetan herbPterocephalushookeri[J].Biochem Syst Ecol，2014，56：209-212.

[8] 程晓华，熊玉卿.五环三萜皂苷的药理作用研究进展[J].中草药，2007，38(5)：792-795.

[9] 冯瑜娟，张艺.HPLC法测定藏药翼首草中齐墩果酸和熊果酸的含量[C]//中国中西医结合学会中药专业委员会.2007年中国中西医结合学会中药专业委员会全国中药学术研讨会论文集[C].长沙：中国中西医结合学会中药专业委员会，2007：16-18.

[10] 田婧.一种翼首草的人工栽培方法：CN104012266A[P].2014-09-03.

[11] 甘玉伟，陈灼，旦智草，等.藏药翼首草的人工栽培试验研究[J].甘肃科技纵横，2006(3)：225.

[12] 马雄，马怀义，马诲财，等.藏药植物匙叶翼首草的人工栽培技术[J].林业实用技术，2011(2)：42-43.

[13] 丁宝峰，尚永芳，李风庆.藏药材翼首草人工栽培技术[J].甘肃农业科技，2004(1)：46.

ContentsDeterminationofOleanolicAcidandUrsolicAcidofPterocephalushookeri

QUANHong1，ZHENZijuan1，LILianqiang1，CHENMin2，LANXiaozhong1*

(1.MedicinalPlantsResearchCenter，AgriculturalandAnimalHusbandryCollegeofTibetUniversity，Linzhi860000，China；2.CollegeofPharmaceuticalSciences，SouthwestUniversity，Chongqing400715，China)

Objective：The spatiotemporal dynamic analysis of oleanolic acid and ursolic acid in different growth years of whole plant ofPterocephalushookeriwas determined by HPLC.Methods：The HPLC method was performed on a YMC-ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column with methanol and 0.1% ammonium acetate-water as the mobile phase.Isocratic elution with flow rate at 1 mL·min-1.The detection wavelength was 210 nm and the column temperature was controlled at 35 ℃.Results：The content of oleanolic acid from 5 to 150 mg·L-1showed a good linearity，the average recovery was 101.17%，the content of ursolic acid from 20 to 600 mg·L-1showed a good linearity，the average recovery was 100.69%.The contents of oleanolic acid inP.hookeriranged from 0.199 to 0.946 mg·g-1，the contents of ursolic acid ranged from 0.737 to 6.750 mg·g-1.Conclusion：There is a significant differencein the spatiotemporal dynamic analysis of oleanolic acid and ursolic acid in different growth years ofP.hookeri.

Pterocephalushookeri；oleanolic acid；ursolic acid；contents determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.6.016

2015-12-17)

中央本级重大增减支项目(2060302)；西藏自治区科学技术厅重大科技计划(20131225)；西藏自治区教育厅藏药材资源与开发利用创新团队建设项目

*

兰小中，教授，博士，研究方向：药用植物资源与开发利用；Tel：(0894)5826471，E-mail：lanxiaozhong@163.com