脐血干细胞移植对小鼠脑梗死后神经功能的影响

潘晓峰　张细六　张　媚

1)武汉市第一医院神经内科　武汉　430050　2)武汉市第五医院　武汉　430050



脐血干细胞移植对小鼠脑梗死后神经功能的影响

潘晓峰1)张细六1)张媚2)△

1)武汉市第一医院神经内科武汉4300502)武汉市第五医院武汉430050

目的探讨脐血干细胞移植对小鼠脑梗死后神经功能的影响，以期为临床治疗提供依据。方法先对小鼠进行模型，随机分成阿司匹林组、生理盐水组和脐血干细胞移植组，分别造模后1 d灌胃生理盐水、阿司匹林、脐血干细胞移植，观察在血清NGF和神经功能变化情况。结果治疗前3组间NGF水平、生理盐水组和阿司匹林组治疗28 d后比较差异无统计学意义(P>0.05)；余3组治疗前后和治疗后7、14、21、28 d比较差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗前神经功能均为0，治疗后和治疗前在神经功能评分上比较差异有统计学意义(P<0.05)；生理盐水组组、阿司匹林组、脐血干细胞移植组治疗后7、14、21、28 d神经功能评分两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论脐血干细胞移植能改善小鼠脑梗死后神经功能。

脐血干细胞移植；小鼠；脑梗死；神经功能

脑梗死是神经内科常见病和多发病，致残率和致死率较高，其原因是神经元再生困难。研究[1]称，神经突触是神经元信息传递和加工重要结构，如何促进神经突触再生是促进损伤神经修复的重要环节。而脐血干细胞能将干细胞转移至缺血边缘地带，分化成胶质神经、血管内皮细胞，能促进新血管形成。本次研究通过观察脐血干细胞移植对小鼠脑梗死后神经功能的影响，以期提高临床诊治水平。

1　资料与方法

1.1动物随机选取75只小鼠为研究对象，分成3组，每组25只，均为雄性，平均体质量(45±5)g，入选动物均符合动物实验要求，均饲养1周。

1.2实验试剂试剂有胎牛血清、人淋巴细胞分离液、终止液、青链霉素、24孔培养板、CO培养箱、定量ELISA试剂盒，均由上海阳光生物科技有限公司。

1.3动物分组和模型制备随机将所有小鼠分成阿司匹林组、生理盐水组和脐血干细胞移植组，每组25只。

1.4观察指标和方法先进行脐血干细胞分离，均取自自愿提供的孕妇中，排除携带病毒性肝炎、艾滋病和梅毒等感染，在采集12 h后进行单个核细胞分离，肝素抗凝后将脐血和PBS按1：1混匀后和5 g/L甲基纤维素按4：1混匀，吸取上层清液，弃除上层清液，用PBS制成单个细胞悬液，叠加淋巴细胞分离液上进行梯度离心，然后洗涤、反复吹打，制备成细胞悬液，将细胞调整成1×108/L保存，2 h内对小鼠进行细胞移植。对所有小鼠进行脑梗死模型制备，用水合氯醛腹腔注射麻醉，按照文献[2]相关方法在大脑中动脉进行局限向栓塞。在颈中切开，结扎颈外动脉，用多聚赖氨酸处理尼龙线至大脑前动脉起始处，阻塞大脑中动脉主干起始部，1 d内观察小鼠神经功能。所有模型均制备成功。然后对各组进行相应药物治疗，阿司匹林组组阿司匹林1 mg灌胃，生理盐水组予3 mg/kg静脉注射，1次/d，脐血干细胞移植组则在小鼠尾静脉处注射3 mL人脐血干细胞1 mL磷酸缓冲液。

1.5观察指标分别在实验前、实验后7 d、14 d、21 d、28 d，采集静脉血2 mL，以4 000 r/min离心后分离血清，采用双抗体夹心测定标本中神经生长因子(NGF)水平，观察神经功能评分，包括运动、感觉、反射、平衡试验，从0～18进行分级，正常为0分，最严重为功能缺损为18分[3]。

2　结果

2.13组血清NGF水平比较对3组血清NGF水平进行比较，治疗前3组间NGF水平、生理盐水组和阿司匹林组治疗28 d后比较差异无统计学意义(P>0.05)；余3组治疗前后和治疗后7、14、21、28 d比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　3组血清NGF水平比较

注：A组、B组、C组分别代表生理盐水组组、阿司匹林组、脐血干细胞移植组

2.23组神经功能比较对3组神经功能进行比较，治疗前3组神经功能评分均为0，治疗后和治疗前神经功能评分比较差异有统计学意义(P<0.05)，生理盐水组组、阿司匹林组、脐血干细胞移植组治疗后7、14、21、28 d神经功能评分两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　3组神经功能比较

注：A组、B组、C组分别代表生理盐水组组、阿司匹林组、脐血干细胞移植组

3　讨论

目前用于中枢神经移植的供体细胞主要有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞及脐血干细胞等。脐血干细胞是近年来发现的一类具有骨髓干细胞、外周血干细胞有相同多向分化潜能的原始祖细胞，能在特定因子的影响和诱导下向多种细胞或组织分化，能对脑梗死缺血及受损组织进行结构和功能的修复。且其自我更新能力强，具有高度未分化性和多向分化潜能，能替代死亡细胞诱导内源性神经再生，能释放神经保护和免疫调节作用，其中脐血干细胞具有来源丰富、采集方便、抗原性弱、不受病毒和肿瘤污染特点。研究[4]称，脐血干细胞中CD3、CD4细胞群占95%以上，能通过免疫调节多种血管活性物质，达到控制干细胞命运，且调节新生细胞数量和种类。

研究[5]称，脐血干细胞移植治疗脑卒中的机制是减轻炎症反应，增加营养物质吸收，促进血管再生和神经纤维重塑，其中减轻炎症反应主要是抑制淋巴细胞、中性粒细胞等浸润、减少星形细胞等激活，脑梗死后会发生一系列炎症反应，而脐血细胞则能通过影响炎症级联反应达到降低免疫反应，增加神经功能效果。研究[6-8]称，脐血干细胞移植有以下几个方面作用：(1)能分泌多种神经营养因子，如神经生长因子、胶质神经源性神经营养因子等，而这些因子中以神经生长因子最为重要，该因子能促进脑梗死后脑组织分化形成神经细胞，且能抑制病灶区域神经细胞凋亡，促进脑梗死神经细胞轴突生长和修复，在本次研究中得到明显体现，和阿司匹林相类似。(2)能促进新血管生长，研究称脐血干细胞能通过调节血管内皮细胞生长因子直接和间接作用，促进梗阻的微血管修复和再生能力，对神经修复有一定恢复作用。(3)能减少脑梗死区域炎症水肿，缩短治疗时间，研究称，脐血干细胞能增强血液通透性，能抑制血小板聚集，降低白细胞介素1等炎症因子反应。(4)脐血干细胞移植能减少损伤后局部神经细胞凋亡，从而起到保护神经功能作用。研究[9]称，脐血干细胞移植后小鼠脊髓损伤组织内神经元和胶质细胞等Fas表达受到抑制，会造成有些神经信号传导通路下调，促使XIAP表达增加，抑制神经细胞凋亡。

但需指出的是，脐血干细胞移植具有两面性，其再生潜能修复组织能治疗临床上很多疾病，但其又具有复制性和克隆性，若不受控制生长则会演变为不可控制的肿瘤，故在临床上要运用恰当，如何调节脐血干细胞量化分离纯化，扩增和贮存，调控细胞和宿主之间特定细胞分化而不过度增殖也是研究重点[10]。另外有学者称，脐血干细胞能促进GDNF在损伤脊髓中局部表达，在损伤局部能分泌突胶质细胞分泌的BDNFNT-3，故能提高神经功能。

[1]唐映，杨万章，胡国恒，等.脐血干细胞移植治疗脑卒中的研究现状[J].中国组织工程研究与临床康复，2013，11(46)：9 361-9 364.

[2]潘凤华，李晓波，丁新生，等.人脐血干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究[J].临床神经病学杂志，2012，19(2)：121-123.

[3]潘凤华.人胚神经干细胞及人脐血干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究[D].南京：南京医科大学，2012.

[4]王清勇，杨松林，朱德茂，等.脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠脑内NGF、BDNF表达的影响[J].中国误诊学杂志，2012，12(16)：4 122-4 124.

[5]刘海英，李建峰，李洪均，等.人脐血CD34+细胞移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能恢复的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2013，12(3)：451-455.

[6]Seghatoleslam M，Jalali M，Nikravesh MR，et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood-mononuclear cells dose-dependently relieve neurologic deficits in rat intracerebral hemorrhage model[J].Ann Anat，2013，195(1)：39-49.

[7]丁洁，程焱.脐血间充质干细胞及其在脑梗死治疗中的作用[J].国际脑血管病杂志，2012，15(8)：607-611.

[8]马建华，吴月奎，易波，等.脐血源神经干细胞移植改善局灶性脑缺血大鼠神经功能障碍[J].中华神经医学杂志，2014，13(4)：353-357.

[9]欧雅莉，余国龙.经体循环脐血细胞移植治疗脑梗死机制及其疗效影响因素[J].心血管病学进展，2012，31(5)：733-735.

[10]刘剑宇.银杏达莫联合脐血间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死[J].医学信息，2013，26(4)：234-235.

(收稿2015-08-10)

张媚，E-mail：420663068@qq.com

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1673-5110(2016)17-0021-03