艾燃烧生成物化学评价与控制模型建立探索性研究

靳　然　赵百孝　于密密　郭洪祝　傅欣彤　陈有根

(1 中国中医科学院广安门医院南区，北京，102618； 2 北京中医药大学，北京,100029； 3 北京市药品检验所，北京，102206)



艾燃烧生成物化学评价与控制模型建立探索性研究

靳然1赵百孝2于密密3郭洪祝3傅欣彤3陈有根3

(1 中国中医科学院广安门医院南区，北京，102618； 2 北京中医药大学，北京,100029； 3 北京市药品检验所，北京，102206)

目的:初步建立艾燃烧生成物化学评价与控制模型。方法:采用SPME-GC联用技术对艾燃烧生成物进行检测，建立了艾燃烧生成物的指纹图谱；运用matlab数学软件提取既有样品艾烟气相色谱图的29个共有峰进行聚类，绘制出艾烟特征曲线；运用matlab数学软件提取29个峰的信息进行主成分分析。结果:艾燃烧生成物指纹图谱和特征曲线2种方法计算得到的相似度结果相近，主成分分析中精细艾绒离聚类中心较远。结论:艾燃烧生成物指纹图谱、特征曲线的测定及主成分分析可以将艾烟更全面的加以描述，可以进一步综合利用人工神经网络或遗传算法将艾燃烧生成物的化学评价和控制模型进行优化。

艾燃烧生成物；化学评价与控制模型；特征曲线；主成份分析；指纹图谱

艾灸疗法是以艾绒为主要材料，点燃后在体表一定的部位进行烧、灼、熏、熨，给人体以温热、药物刺激作用，以防治疾病的一种外治法。几千年的临床实践证明其安全有效，但艾灸作用的效应机制目前不完全清楚，一般认为除温热、光效应之外，艾绒燃烧生成的烟气，可通过呼吸道及施灸部位作用于人体，起到一定的治疗作用[1-3]。艾燃烧生成物是艾绒燃烧时生成的烟气，文献报道中有艾烟、艾灸生成物、艾燃烟、艾叶挥发性物质等多种名称。

艾燃烧生成物是艾灸疗法起效的一个很重要的因素，所以对艾燃烧生成物即艾烟进行系统研究尤为重要。艾烟的化学成分组成不但与其燃烧充分程度有关，还与艾绒质量有关，如产地、存储时间、制作比例等等。所以本研究收集大批量不同质量的艾绒，采用SPME-GC联用技术对艾燃烧生成物进行检测，建立艾燃烧生成物的指纹图谱，并在此基础上建立一个稳定真实可靠的艾燃烧生成物的化学评价和控制模型。以期为艾灸诊室空气质量标准提供数据，为搭建艾灸临床、科研的技术平台和操作规范奠定基础。

1　艾烟指纹图谱研究

有关艾叶及艾烟的定性分析的文献很多[4-11]，靳然等人[12-13]对艾叶及艾烟中的某几个成分也进行了定量测定，但是并不能反映艾烟的整体特征。中药指纹图谱[14]可以全面反映中药所含内在化学成分的种类与数量，为了将艾烟更全面的加以描述，进行了艾烟指纹图谱的研究。

1.1仪器与材料气相色谱(GC，Agilent Technologies,6980N)，安捷伦毛细管柱(HP-5,30 m×0.32 mm×0.25 μm)。Supelco固相微萃取手柄，萃取头型号包括75 μm Carboxen/PDMS。定制密闭玻璃仪器(18.5L)，顶盖有小孔，配有橡胶塞。

2007年不同比例艾绒(3∶1、5∶1、8∶1、15∶1)、2008年不同比例艾绒(3∶1、5∶1、8∶1、15∶1)、2009年不同比例艾绒(3∶1、5∶1、8∶1、15∶1)，2010年3∶1艾绒、2011年3∶1艾绒，原料均为蕲艾，产于湖北省蕲春县，采摘于端午前后，由湖北省蕲春县李时珍医药工作办公室提供，河南南阳汉医艾绒厂加工。16个不同产地艾叶(湖北蕲春、湖北襄樊、北京、陕西、江西、山西、安徽、甘肃、河北、辽宁、黑龙江、河南浙川、河南桐柏、河南郑州、河南固始、河南安阳)，均采摘于2010年端午节当天(2010年6月16日)，由北京市药品检验所药师鉴定为正品，由粉碎机加工成3∶1艾绒。市售艾绒：市售艾绒1(3∶1)，市售艾绒2(3∶1)，黄金艾绒1，黄金艾绒2，2003年12∶1艾绒，2005年5∶1艾绒，百笑灸艾绒，南阳陈艾条艾绒，苏州艾条艾绒，同仁堂艾条艾绒，均购于市场。

1.2实验方法及条件

1.2.1样品制备称取样品0.25 g，放在18.5L的密闭容器中点燃，燃尽后待艾烟充满玻璃缸，将萃取头插入密闭容器萃取30 min。把饱和的纤维头在GC进样口解析3 min,然后进行GC检测。

1.2.2气相色谱条件柱温采取程序升温，起始温度为30 ℃，保持3 min；以2 ℃/min升至100 ℃，保持2 min；以4 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；以8 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。进样口温度为220 ℃；检测器温度：250 ℃；分流进样,分流比10∶1。

1.2.3实验条件固相微萃取头型号为75 μm Carboxen/PDMS；萃取时间30 min；解吸附温度为220 ℃；解吸附时间定为3 min。

1.2.4方法学考察萃取头在进样口解吸附后需再次萃取才可进样，所以精密度考察即重复性考察。分别取2009年3∶1艾绒0.2517、0.2518、0.2517、0.2519、0.2517、0.2518 g，按1.2.1方法进行实验，然后进行GC检测。测得艾烟中苯甲醛、苯酚、邻位甲酚、萘的含量RSD%分别为1.9%、0.8%、1.9%、1.8%。实验结果表明该方法重复性和精密度良好。

1.3实验结果将各艾烟样品色谱图输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)，生成共有指纹图谱，相似度在88.7%～99.7%之间。艾烟指纹图谱匹配图见图1。

中药色谱指纹图谱相似度评价系统是根据夹角余弦算法进行相似度计算的[14]，有一定的局限性。在艾烟指纹图谱基础上，利用matlab数学软件对色谱数据进行进一步处理，运用K-means算法、主成分分析法等对数据进行建模分析。

2　艾烟特征曲线研究

运用matlab数学软件提取既有样品艾烟的气相色谱图的29个共有峰进行聚类，并将4个伪品艾绒样品艾烟和8个市售艾绒样品艾烟与绘制的艾烟特征曲线进行比较。

29个成分峰保留时间分别为：6.5 min，6.8 min，11.4 min(3-糠醛)，13.3 min，15.1 min，17.4 min(2(5H)呋喃酮)，20.7 min(苯甲醛)，21.2 min，22.6 min，23.0 min(苯酚)，23.3 min，25.9 min(D-柠檬烯)，28.3 min(邻位甲酚)，28.7 min，29.9 min(对位甲酚)，30.5 min，30.8 min，34.1 min，35.0 min，36.9 min(萘)，37.3 min，37.9 min，40.9 min，43.6 min，46.2 min，47.8 min，48.8 min，51.3 min。

K-means算法是数据点到原型的某种距离作为优化的目标函数，利用函数求极值的方法得到迭代运算的调整规则[15]。K-means算法以欧氏距离作为相似度测度，采用误差平方和准则函数作为聚类准则函数。使用艾烟指纹图谱中所得色谱结果，运用Matlab软件利用K-means方法分析计算，得出艾烟特征曲线。见图4。

图1　艾烟指纹图谱匹配图

图2　艾烟生成对照图谱

图3　艾烟气相总离子流图

图4　艾烟特征曲线

本实验通过corrcoef函数计算各样品(包括4个伪品艾叶制作的艾绒)与艾烟特征曲线的相似度，并与中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)计算的相似度进行比较。见表1。由表1可知，2种方法计算得到的相似度结果相近。用K-means方法计算相似度低于95%的样品有2007年15∶1艾绒，2009年15∶1艾绒，黄金艾绒1和黄金艾绒2和苏州艾条艾绒等5个样品。其共同特点除了苏州艾条艾绒外，其他艾绒样品的加工比例都较高；而苏州艾条艾绒大部分是叶梗，所含叶肉部分较少；黄金艾绒1为网购产品，其精度较高，肉眼观察几乎不含叶肉组织，但其他艾绒样品均含墨绿色叶肉组织。用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)计算所得相似度也是这5种较低，但均大于85%，而K-means方法中黄金艾绒的相似度极低。说明2种方法得到的相似度结果基本一致，而以欧氏距离计算相似度的K-means算法和以夹角余弦算法计算相似度的相似度软件计算结果上略有差异。

3　艾烟主成分分析

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法，它对多变量表示数据点集合寻找尽可能少的正交矢量表征数据信息特征[15]。将表1中编号为1～31的样品的色谱图输入matlab软件提取29个峰的信息进行主成分分析。

样本相关矩阵R的特征值及贡献率如下。

前3个样本主成分累计贡献率已达到92.8%，故只需取前3个主成分即可，得到样本3个主成分为。

y1=0.076810405x1+0.18513043x2-0.012300812x3+0.005326342x4+0.17253542x5

+0.018965455x6+0.12233716x7+0.095492803x8-0.1145388x9

+0.006976188x10-0.034464233x11-0.23349492x12+0.15368579x13

+0.15485451x14+0.082569562x15+0.14994298x16+0.24272339x17

-0.26053417x18+0.16764416x19+0.12858307x20+0.021348821x21

+0.037441444x22+0.51264787x23-0.20130903x24-0.11471906x25

+0.041096926x26+0.27621576x27+0.22647269x28-0.37496969x29

y2=0.066031218x1+0.013347447x2-0.11207993x3-0.047906525x4-0.31919843x5

-0.13414489x6-0.21828088x7+0.053445272x8-0.058235083x9

-0.015083943x10-0.11224782x11+0.02993799x12+0.15648882x13

+0.018708408x14+0.23454219x15-0.2116186x16+0.021527488x17

+0.23053724x18-0.039812017x19+0.29989642x20-0.33023989x21

+0.32480296x22-0.1412456x23-0.12162914x24-0.14695852x25

+0.11241324x26+0.32702026x27-0.30058524x28-0.2061868x29

y3=0.3164807x1+0.60155755x2+0.16723998x3-0.40407914x4+0.1039996x5

-0.096246257x6+0.085433632x7-0.21366894x8+0.034076083x9

-0.3424418x10-0.002548368x11+0.052086554x12-0.20161788x13

-0.014323804x14+0.003088385x15+0.06752903x16-0.17508608x17

+0.10906743x18-0.14640093x19+0.07319825x20+0.031102782x21

-0.023370197x22+0.02634792x23-0.076330401x24-0.045713842x25

-0.086849011x26+0.043849532x27-0.010802703x28+0.13441336x29

图5　主成分分析法样本聚为1类

图6　主成分分析法样本聚为3类

表1　艾烟相似度

从3个样本主成分可以看出，y1的贡献率高达63.7%，y1和y2的累计贡献率为87.3%，所以仅前2个主成分足以反映样本的原始信息。将31个样品信息代入y1和y2方程求值，并进行聚类分析，分别将其聚为1类、 3类，如图5、图6。将表2中编号为32～43的样品重新编号为1～12，将数据信息代入方程，在得到结果的基础上进行检验。图5的聚类中心以※1为标记，聚类半径为43.5，参与聚类的31个样本在图中以圆圈标记○，待检验的12个样本以星号☆标记。图6的3个聚类中心以※数字为标记，其中参加聚类的31个样本根据1、2、3类不同，分别以○、△、◇标记，而待检验的12个样本以☆标记。

由图5可知所有的艾烟样品都聚在※1的四周，进行检验的12个样品中百笑灸艾绒、南阳陈艾条艾绒和黄金艾绒1离聚类中心较远，其余所有艾烟样品(包括伪品艾叶制作的艾绒在内)差别不大，可能与艾绒的精度有关。由图6可知，艾烟样品以※1、2、3聚为3类，在分类上没有明显规律，但百笑灸艾绒、南阳陈艾条艾绒、黄金艾绒1和黄金艾绒2离聚类中心较远。可能因为精细艾绒的样本量偏少，所以离聚类中心较远，推测收集大量样本的精细艾绒通过matlab的主成分分析法可以将不同精细度的艾绒分别聚类。

表2　特征值及贡献率

4　艾燃烧生成物化学评价与控制模型的建立

根据艾烟指纹图谱、特征曲线和主成分分析实验结果，建立艾燃烧生成物的化学评价与控制模型。

4.1艾燃烧生成物的测定方法准确称量0.25 g艾绒，置于18.5L密闭容器中点燃，待其燃尽烟气混匀后用75 μm CAR/PDMS型号固相微萃取头萃取30 min,在进样口解吸附3 min,然后进行GC分析。

色谱条件：安捷伦毛细管柱(HP-5,30 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱温采取程序升温，起始温度为30 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升至90 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至105 ℃，以8.0 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。进样口温度为220 ℃；检测器温度：250 ℃；分流进样,分流比10∶1。

4.2艾燃烧生成物指纹图谱的测定将所得色谱图输入中药色谱指纹图谱相似度评价软件与图2的生成对照图谱进行比较，相似度不得低于85%。

4.3艾燃烧生成物特征曲线的测定利用matlab软件提取保留时间分别为6.5 min，6.8 min，11.4 min(3-糠醛)，13.3 min，15.1 min，17.4 min(2(5H)呋喃酮)，20.7 min(苯甲醛)，21.2 min，22.6 min，23.0 min(苯酚)，23.3 min，25.9 min(D-柠檬烯)，28.3 min(邻位甲酚)，28.7 min，29.9 min(对位甲酚)，30.5 min，30.8 min，34.1 min，35.0 min，36.9 min(萘)，37.3 min，37.9 min，40.9 min，43.6 min，46.2 min，47.8 min，48.8 min，51.3 min的29个成分的信息，绘制艾烟特征曲线，并与图4中生成的对照特征曲线进行比较，相似度不得低于85%。

4.4艾燃烧生成物主成分分析艾烟3个主成分特征方程。

y1=0.076810405x1+0.18513043x2-0.012300812x3+0.005326342x4+0.17253542x5

+0.018965455x6+0.12233716x7+0.095492803x8-0.1145388x9

+0.006976188x10-0.034464233x11-0.23349492x12+0.15368579x13

+0.15485451xx14+0.082569562x15+0.14994298x16+0.24272339x17

-0.26053417x18+0.16764416x19+0.12858307x20+0.021348821x21

+0.037441444x22+0.51264787x23-0.20130903x24-0.11471906x25

+0.041096926x26+0.27621576x27+0.22647269x28-0.37496969x29

y2=0.066031218x1+0.013347447x2-0.11207993x3-0.047906525x4-0.31919843x5

-0.13414489x6-0.21828088x7+0.053445272x8-0.058235083x9

-0.015083943x10-0.11224782x11+0.02993799x12+0.15648882x13

+0.018708408xx14+0.23454219x15-0.2116186x16+0.021527488x17

+0.23053724x18-0.039812017x19+0.29989642x20-0.33023989x21

+0.32480296x22-0.1412456x23-0.12162914x24-0.14695852x25

+0.11241324x26+0.32702026x27-0.30058524x28-0.2061868x29

y3=0.3164807x1+0.60155755x2+0.16723998x3-0.40407914x4+0.1039996x5

-0.096246257x6+0.085433632x7-0.21366894x8+0.034076083x9

-0.3424418x10-0.002548368x11+0.052086554x12-0.20161788x13

-0.014323804xx14+0.003088385x15+0.06752903x16-0.17508608x17

+0.10906743x18-0.14640093x19+0.07319825x20+0.031102782x21

-0.023370197x22+0.02634792x23-0.076330401x24-0.045713842x25

-0.086849011x26+0.043849532x27-0.01080270x28+0.13441336x29

利用matlab提取所测艾烟气相色谱图的29个峰信息，进行主成分分析，并将其标准化后的信息代入上述前2个方程中，聚类后应在图5的范围内，半径为43.5。

5　讨论

用SPME-GC-MS联用技术只能检测到艾燃烧生成物中少量的挥发油成分[6]，可能与本方法测定艾烟取样量较小有关。所以艾燃烧生成物的化学评价与控制模型的建立并没有涉及到不同艾绒样品挥发油成分，这可能是伪品所制艾绒与正品艾绒烟气差别不大的原因之一。

中药色谱指纹图谱相似度评价系统是根据夹角余弦算法进行相似度计算的，主要反映的艾烟的整体特征，有一定的局限性。而艾烟的特征曲线绘制是基于峰面积的检测，反映的是艾烟中各成分的相对含量，所以艾烟特征曲线与指纹图谱的测定可以将艾烟更全面的加以描述。

艾烟的主成分分析中，艾绒的样本量偏少。精细艾绒离聚类中心较远，推测收集大量样本的精细艾绒通过matlab的主成分分析法可以将不同精细度的艾绒分别聚类。该模型中的主成分分析特征方程中特征向量较多，可以综合利用人工神经网络或遗传算法将其进一步精简，将艾燃烧生成物的化学评价和控制模型进行优化。

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(2016-06-28收稿责任编辑：洪志强)

Exploratory Study on the Chemical Assessment and Control Model of Moxa Smoke

Jin Ran1, Zhao Baixiao2, Yu Mimi3, Guo Hongzhu3, Fu Xintong3, Chen Yougen3

(1Guang′anmenHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing102618,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 3BeijingInstituteforDrugControl,Beijing102206,China)

Objective:To establish a chemical assessment and control model for moxa smoke. Methods: Using SPME-GC technique to assess moxa smoke and establish a finger-print of that. At the same time, using matlab software to aggregate the 29 common peaks of current moxa smoke prints and draw a feature curve for moxa smoke, then analyze the main content. Results: The results retrieved by fingerprint and feature curve were identical, and the main content analysis showed that fine moxa has a far distance from the cluster center. Conclusion: Moxa smoke can be comprehensively analyzed by finger-print, feature curve and main content analysis. Artificial nerve-net or genetic algorithm can be used in optimizing the chemical assessment and control model.

Combustion Product of Moxa floss; Chemical evaluation and control model; characteristic curve; Principal component analysis; Fingerprint

国家自然科学基金项目(编号：81373730)；国家自然科学基金项目(编号：81574068)；国家青年自然基金项目(编号：81403449)；国家国际科技合作专项项目(编号：2011DFA31370)

靳然(1982—)，女，主治医师，中国中医科学院广安门医院南区针灸科

赵百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生导师，北京中医药大学针灸推拿学院院长，研究方向：艾灸作用与原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.003