怀牛膝果寡糖对H1N1流感疫苗佐剂活性及免疫细胞功能的影响

汪艳艳，李海霞，巫亚俊，赵修南，麻　浩，刘坤璐，武军华，单俊杰，王玉霞，王海南（1.贵州大学药学院，贵州贵阳 55005；.军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850；3.国家食品药品监督管理总局，北京100053）

怀牛膝果寡糖对H1N1流感疫苗佐剂活性及免疫细胞功能的影响

汪艳艳1，2，，李海霞2，巫亚俊2，赵修南2，麻浩2，刘坤璐2，武军华2，单俊杰2，王玉霞2，王海南1，3
（1.贵州大学药学院，贵州贵阳 550025；2.军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850；3.国家食品药品监督管理总局，北京100053）

目的 研究牛膝果寡糖ABP-50-FOS对H1N1流感疫苗的佐剂活性及免疫细胞功能的影响。方法 采用凝胶渗透色谱、毛细管电泳、红外光谱和核磁共振等方法研究ABP-50-FOS的理化性质；BALB/c小鼠肌肉注射H1N1流感疫苗3 μg和ABP-50-FOS 200 μg初次免疫，28 d后加强免疫。分别于初次和再次免疫后14 d用ELISA法检测小鼠血清特异性IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgM抗体水平；流式细胞仪测定脾细胞中CD3+，CD19+，CD4+和CD8+淋巴细胞亚群百分率；MTT法测定小鼠脾细胞增殖活性；ELISA法测定脾细胞培养上清干扰素γ（IFN-γ）、胸腺细胞培养上清白细胞介素4（IL-4）、腹腔巨噬细胞培养上清肿瘤坏死因子α（TNF-α）和一氧化氮及小鼠骨髓细胞和DC2.4树突状细胞培养上清IL-12p70含量。结果ABP-50-FOS是一种果寡糖，峰高分子质量为1885 u，骨架结构为1，2-连接和1，6-连接的果糖。该寡糖能明显升高H1N1流感疫苗免疫小鼠血清特异性IgG，IgG2a和IgM抗体水平（P＜0.01），提高免疫小鼠脾CD3+，CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分率。体外实验表明，ABP-50-FOS能促进小鼠脾细胞增殖反应和IFN-γ分泌（P＜0.01），促进胸腺细胞IL-4分泌（P＜0.01），刺激腹腔巨噬细胞分泌TNF-α（P＜0.01）和DC2.4树突状细胞分泌IL-12p70（P＜0.01），对巨噬细胞一氧化氮的分泌有抑制作用。结论 牛膝果寡糖ABP-50-FOS对H1N1流感疫苗具有良好的佐剂活性，体外对小鼠免疫细胞功能具有促进作用。

牛膝；多糖；果寡糖；疫苗；佐剂

怀牛膝（Achyranthes bidentata Blume）为苋科多年生草本植物，其干燥根入药，可用来治疗肝阳眩晕、产后腹痛、跌打损伤等病症［1］。多糖作为牛膝药材的主要活性成分之一，近年来对其研究和报道较多，如免疫调节［2］、抗肿瘤［3］、抗凝血［4］、抗病毒［5］、抗疟疾［6］和治疗关节炎［7］等作用。邱妍等［8］采用水煎醇沉法提取怀牛膝粗多糖（糖含量为54%），用该多糖点眼滴鼻免疫鸡新支二联弱毒苗，同时分别肌肉注射怀牛膝多糖1.5或3.0 mg。结果表明，怀牛膝多糖3.0 mg能提高抗体效价，促进T淋巴细胞增殖。封海波等［9］在室温下采用超声辅助水提醇沉法提取牛膝粗多糖（糖含量为78.9%），分别按25，50 和100 mg·kg-1与O型口蹄疫灭活疫苗协同免疫ICR小鼠2次。结果发现，牛膝粗多糖明显增强共刺激信号分子CD40，CD80和CD86的表达水平，同时提高主要组织相容性复合体Ⅰ（major histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ）、MHC-Ⅱ、趋化因子受体 4（chemokine receptor 4，CXCR4）和CC趋化因子受体7（CC chemokine receptor 7，CCR7）mRNA表达水平。上述研究表明，牛膝粗多糖具有显著的疫苗佐剂活性，但对其中的活性成分尚未见进一步的追踪和报道。

本研究在50℃条件下采用水提、醇沉、透析和冷冻干燥方法制备牛膝粗多糖ABP-50。ABP-50 经DEAE-纤维素柱层析获得多糖组分ABP-50-A，再用Sephadex G-50柱纯化，获得果寡糖ABP-50-FOS。继而采用H1N1流感疫苗评价该果寡糖的疫苗佐剂活性，同时评价该寡糖对疫苗免疫小鼠及正常小鼠免疫细胞功能的影响，为深入研究牛膝果寡糖佐剂作用机制提供实验依据。

1　材料与方法

1.1药材、试剂、仪器和动物

怀牛膝购于北京同仁堂药店，产地河南，批号30770101，北京三和药业有限公司炮制。牛膝果寡糖ABP-50-FOS由本课题组分离和纯化获得。甲型H1N1流感病毒裂解液由北京科兴生物制品有限公司生产；刀豆蛋白（concanavalin A，Con A）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）均购自美国Sigma公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG和兔抗山羊IgG和N-四甲基联苯胺（TMB）均购自北京中杉金桥生物技术公司；小鼠抗体及亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM和IgA）测定试剂盒购于美国Sigma公司；PerCP标记仓鼠抗小鼠CD3e、APC标记大鼠抗小鼠CD19、PE标记大鼠抗小鼠CD4以及FITC标记大鼠抗小鼠CD8抗体均购于美国BD Bioscience公司；小鼠干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）4、IL-12和一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）ELISA试剂盒均购于欣博盛生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；MTT购自Amresco公司。Varioskau Flash version 2.4.3酶标仪和F1-01620型洗板机均为美国Thermo Scientific公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品。BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，合格证号：军科院SCXK（军）2012-001，由军事医学科学院实验动物中心供给。DC2.4细胞株购于上海研谨生物科技有限公司。

1.2ABP-50-FOS的制备

怀牛膝1 kg粉碎，加入15 L去离子水浸泡，在50℃条件下提取4 h。离心，残渣采用同样条件重复提取1次，合并上清液，55℃减压浓缩至2 L，然后加入95%乙醇8 L进行醇沉48 h。离心，沉淀部分加入1 L水搅拌溶解、离心。沉淀部分再重复加水2次溶解，合并上清液，装入透析袋（截留分子质量＞1000 u），流水透析48 h，去离子水透析24 h。袋内溶液离心、减压浓缩和冷冻干燥，获得粗多糖ABP-50。ABP-50 500 mg溶于20 mL水，上样于DEAE-纤维素层析柱，连续采用水和NaHCO30.25 mol·L-1洗脱，蒽酮-硫酸法检测含糖流份，收集、透析、冷冻干燥，分别获得ABP-50-A和ABP-50-B组分。ABP-50-A 200 mg溶于2 mL水，上样于Sephadex G-50层析柱，水洗脱，蒽酮-硫酸法检测含糖流分，收集、冷冻干燥，获得分子质量均一的多糖成分ABP-50-FOS。

1.3ABP-50-FOS的理化性质

采用凝胶过滤色谱法测定果寡糖ABP-50-FOS的纯度和分子质量［10］，毛细管电泳法测定其单糖组成［11-12］。IR，［1H］NMR和［13C］NMR确定其结构特点。

1.4H1N1流感疫苗免疫方案

BALB/c小鼠随机分为4组：生理盐水组、H1N1抗原组、H1N1+ABP-50-FOS组和H1N1+铝佐剂组，每组6只。H1N1抗原的免疫剂量为每只小鼠3 μg，ABP-50-FOS和铝佐剂的剂量均为每只小鼠200 μg。采用后肢内侧肌内注射途径，初次免疫28 d进行再次免疫，分别在初次和再次免疫后14 d小鼠尾静脉采血，分离血清，测定血清特异性IgG抗体及亚类抗体滴度。

1.5ELISA法检测血清IgG类抗体滴度

小鼠血清用含0.1%吐温-20的磷酸缓冲溶液（PBST，pH 7.4）按1∶400的比例稀释。采用抗原2 g·L-1包被96孔板，每孔100 μL，4℃包被过夜。每孔再加入1%牛血清白蛋白200 μL，37℃孵育封闭1 h。封闭后用PBST洗3次，然后每孔加入100 μL倍比稀释的血清（以1∶400稀释液为原液），再37℃继续孵育1 h。用PBST洗板3次后，每孔加入1∶1000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体100 μL，37℃孵育1 h。再用PBST洗板5次，TMB底物显色，用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度（A450nm）。

1.6ELISA法检测血清IgM，IgA和IgG亚类抗体滴度

抗原用碳酸盐缓冲液0.5 mol·L-1（pH 9.6）稀释，终浓度为3 mg·L-1，加入96孔板中，每孔100 μL，4℃包被过夜。每孔用PBST洗3次后加入5%脱脂奶粉37℃封闭1 h。PBST洗涤3次，加入100 μL倍比稀释的血清（以1：400稀释液为原液），37℃继续孵育1 h。PBST再洗涤3次，每孔加入山羊抗小鼠（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM和IgA）抗体100 μL（用PBST 1∶1000倍稀释），37℃孵育1 h。PBST洗涤3次，加入HRP标记的兔抗山羊IgG抗体100 μL（用PBST 1∶1000倍稀释），37℃孵育1 h。再用PBST洗涤5次，加入TMB显色底物，每孔100 μL，室温避光显色15 min。最后每孔加入0.2 mol·L-1硫酸溶液50 μL终止显色，酶标仪测定A450 nm。

1.7流式细胞仪检测脾B淋巴细胞和T细胞亚群

H1N1流感疫苗免疫后28 d小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死。无菌条件下取脾制备脾细胞悬液，调整细胞密度为2×1010L-1。取脾细胞悬液100 μL，加入100 μL混合抗体（含PerCP-仓鼠抗小鼠CD3e抗体0.25 μg，APC-大鼠抗小鼠CD19抗体0.5 μg，PE-大鼠抗小鼠CD4抗体0.125 μg，FITC-大鼠抗小鼠CD8a抗体0.5 μg），每组设3平行管。另外设4个相应的单标抗体对照。室温下避光孵育25 min，各管加入洗液1.5 mL，混匀，4℃离心10 min（600×g），弃上清，再重复离心和洗涤3次，重悬细胞，加入PBS 500 μL摇匀，进行流式细胞仪分析，测定CD3+，CD19+，CD4+和CD8+细胞的百分率。

1.8体外脾细胞增殖活性的测定

正常BALB/c小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出脾，制备脾细胞悬液，用锥虫蓝染色法检测细胞存活率＞95%，进行细胞计数，调整细胞密度为5×109L-1。将计数后的脾细胞悬液按每孔100 μL加入到96孔细胞培养板，各孔分别加入50 μL细胞培养液、Con A（终浓度4 mg·L-1）或LPS（终浓度15 mg·L-1）溶液，各孔再分别加入50 μL ABP-50-FOS溶液（终浓度分别为0，2，10和50 mg·L-1）。每组设3复孔。将培养板置于含5%CO2培养箱中，37℃孵育48 h。加入20 μL MTT（5 g·L-1），继续孵育4 h。弃上清液，每孔中加入150 μL DMSO，酶标仪检测A570 nm，计算细胞增殖百分率。

1.9脾细胞分泌IFN- 和胸腺细胞分泌IL-4水平的测定

BALB/c小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死，无菌摘取脾和胸腺，分别制备脾细胞悬液（5×109L-1）和胸腺细胞悬液（2×1010L-1）。将脾细胞和胸腺细胞悬液分别加入24孔细胞培养板，每孔500 μL。细胞样品孔中加500 μL培养液、Con A（终浓度为2 mg·L-1）或ABP-50-FOS溶液（终浓度分别为2，10和50 mg·L-1），每组设3复孔。然后置于37℃，5%CO2培养箱中培养。脾细胞培养48 h，胸腺细胞培养72 h，然后取出细胞培养液，离心10 min（600×g）收集上清，按照ELISA试剂盒说明书分别测定脾细胞培养上清IFN-γ含量和胸腺细胞培养上清IL-4含量。

1.10腹腔巨噬细胞分泌TNF- 和NO水平的测定

正常BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下腹腔注射含5%FBS的RPMI 1640培养液，然后抽取腹腔溶液，离心10 min（600×g），弃上清，加入红细胞溶胀液后，用细胞培养液洗涤3次。用含10% FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞密度，加入24孔培养板每孔0.5 mL，含5×105个细胞，置于37℃，5%CO2，饱和湿度孵温箱培养2 h。吸去上清，用0.9%NaCl去除未贴附的细胞，每孔分别加入0.5 mL细胞培养液、LPS（终浓度30 mg·L-1）和ABP-50-FOS（终浓度分别为2，10和50 mg·L-1）。每组设3复孔，然后置于培养箱中培养24 h。离心，收集培养液上清，用ELISA试剂盒测定细胞上清液的TNF-α和NO含量。

1.11小鼠骨髓细胞和DC2.4树突状细胞分泌IL-12p70含量的测定

正常BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下剥离和剪断股骨，向骨髓腔内注射细胞培养液，冲洗3次。冲洗液过筛、离心，然后加入Tris-NH4Cl缓冲液裂解红细胞。再用细胞培养液洗涤2次，重悬细胞、计数，然后用含20%FBS的培养液调制密度为4×109L-1骨髓细胞悬液。24孔培养板中加入骨髓细胞悬液（终密度4×108L-1），然后分别加入生理盐水、LPS（终浓度30 mg·L-1）或ABP-50-FOS（终浓度2，10和50 mg·L-1），37℃，5%CO2孵育48 h。离心，测定上清液IL-12p70含量。

取传代培养DC2.4树突状细胞，加入含10%FBS 的RPMI 1640培养液，调整细胞密度为2.5×109L-1。24孔培养板中加入树突状细胞悬液（终密度1.25× 108L-1），分别加入生理盐水、LPS（终浓度30 mg·L-1）及ABP-50-FOS（终浓度2，10和50 mg·L-1），37℃，5%CO2孵育48 h。离心，测定上清液IL-12p70含量。

1.12统计学分析

2　结果

2.1ABP-50-FOS的得率和理化性质

在50℃条件下牛膝经水提、醇沉、透析和冷冻干燥获得粗多糖ABP-50，淡黄色，得率5.76%。ABP-50经DEAE-纤维素柱层析分别得到ABP-50-A 和ABP-50-B组分，得率分别为69.6%和3.2%。ABP-50-A再经Sephadex G-50纯化，获得果寡糖ABP-50-FOS，呈白色片状粉末，得率为85%。

HPGPC分析表明，ABP-50-FOS呈单一对称色谱峰，峰高分子质量为1885 u。IR，［1H］NMR和［13C］NMR图谱与文献报道基本一致［13］，提示ABP-50-FOS可能为已知结构的果寡糖。

2.2ABP-50-FOS对H1N1流感疫苗免疫小鼠体液免疫反应的影响

ABP-50-FOS与H1N1流感疫苗联用初次免疫后14 d，所有免疫组小鼠血清IgG抗体滴度均很低，各组之间无明显差异（图1A）。加强免疫14 d后，与生理盐水组相比，单独H1N1疫苗组血清特异性IgG，IgG1和IgM滴度显著升高（P＜0.01），同时IgG2a和IgG2b滴度也明显升高（P＜0.01）。与单独H1N1疫苗组相比，联用ABP-50-FOS能进一步升高IgG，IgG2a和IgM滴度（P＜0.05，P＜0.01）；相反，铝佐剂显著降低IgG，IgG1和IgM水平（P＜0.01），推测原因之一是铝佐剂可能吸附抗原，影响抗原的释放。上述结果提示，ABP-50-FOS能提高H1N1疫苗免疫小鼠体液免疫反应（图1B和C）。

Fig.1 Co-administration of fructoolgosaccharide ABP-50-FOS adjuvant from A.bidentata with H1N1 influenza vaccine enhances humoral responses.BALB/c mice were immunized intramuscularly with H1N1 antigen 3 μg，ABP-50-FOS 200 μg or alum 200 μg per mouse.Blood samples were collected at 14 d after first（A）and second（B，C）immunizations and total IgG（A，B）and its isotypes（C）titers were measured by ELISA.，n=6.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with saline group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with H1N1 antigen alone group.

2.3ABP-50-FOS对H1N1免疫小鼠脾淋巴细胞亚群的影响

H1N1流感疫苗与ABP-50-FOS联用免疫小鼠2次后，测定对脾T和B细胞分化及T细胞亚群的影响。从表1结果可以看出，与生理盐水组相比，单独H1N1疫苗免疫小鼠2次后，CD19+亚群细胞百分率降低，CD3+细胞百分率及CD3+/CD19+的比值均升高（P＜0.01）。与单独H1N1疫苗组相比，联用ABP-50-FOS能进一步升高CD3+细胞百分率和CD3+/CD19+的比值（P＜0.01），提示H1N1抗原联用ABP-50-FOS有利于向T细胞分化。联用铝佐剂组CD3+细胞百分率和CD3+/CD19+比值明显降低（P＜0.01）。表2结果表明，与生理盐水组相比，单独免疫H1N1抗原能提高CD4+T细胞的百分率（P＜0.05），但对CD8+T细胞的百分率及CD4+/CD8+比值无明显影响。与单独H1N1抗原组相比，联用ABP-50-FOS能明显升高CD4+和CD8+T细胞百分率（P＜0.01），降低CD4+/CD8+比值（P＜0.01）。铝佐剂与ABP-50-FOS相反，降低CD4+T细胞百分率和CD4+/ CD8+比值（P＜0.05）。2.4 ABP-50-FOS体外对正常小鼠脾细胞增殖和分泌IFN- 的影响

Tab.1 Effect of ABP-50-FOS on CD3+and CD19+cell percentage in spleen of H1N1 influenza vaccine immunized mice

BALB/c小鼠脾细胞分别在Con A（4 mg·L-1）或LPS（15 mg·L-1）刺激下，与不同浓度ABP-50-FOS共孵育48 h。表3结果表明，在无丝裂原刺激下，小鼠原代脾细胞与ABP-50-FOS 2，10和50 mg·L-1共孵育48 h能显著促进脾细胞增殖反应。在Con A刺激下脾细胞发生明显增殖（P＜0.01），ABP-50-FOS 10和50 mg·L-1对Con A有协同作用（P＜0.05），而ABP-50-FOS只有在50 mg·L-1浓度下对LPS有协同效应（P＜0.05）。表4结果表明，与生理盐水组相比，ABP-50-FOS 3个浓度均能明显促进脾细胞分泌IFN-γ（P＜0.01）。推测ABP-50-FOS能提高小鼠脾T和B细胞增殖反应，促进T细胞向Th1细胞分化。

Tab.2 Effect of ABP-50-FOS on CD4+and CD8+T cell percentage in spleen of H1N1 influenza vaccine immunized mice

Tab.3 Splencyte proliferation of BALB/c mice stimulated by ABP-50-FOS in vitro

Tab.4 Effect of ABP-50-FOS on interferonI- （IFN- ）secretion of splencytes in BALB/c mice in vitro

2.5ABP-50-FOS对胸腺细胞分泌IL-4的影响

由表5可见，BALB/c小鼠胸腺细胞在生理盐水、Con A或不同浓度ABP-50-FOS刺激下培养72 h，与生理盐水组相比，Con A刺激能显著促进小鼠胸腺细胞IL-4的分泌（P＜0.01）；ABP-50-FOS 2，10和50 mg·L-1也能显著刺激小鼠胸腺细胞分泌IL-4。

Tab.5 Effect of ABP-50-FOS on interleukin-4（IL-4）secretion of thymocytes in BALB/c mice in vitro

2.6ABP-50-FOS对腹腔巨噬细胞分泌TNF- 和NO的影响

BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞在生理盐水、LPS或不同浓度ABP-50-FOS刺激下培养24 h，测定细胞培养上清液中TNF-α和NO的含量。表6结果表明，LPS能刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α （P＜0.01），但对NO分泌无影响。ABP-50-FOS 50 mg·L-1LPS作用相似，也能促进TNF-α的分泌（P＜0.01），但对NO的分泌有一定抑制作用（P＜0.05）。

Tab.6 Effect of ABP-50-FOS on tumor necrosis factor-（TNF- ）and nitrogen monoxide（NO）secretions of peritoneal macrophages in BALB/c mice in vitro

2.7ABP-50-FOS对小鼠骨髓细胞和DC2.4树突状细胞系分泌IL-12p70的影响

BALB/c小鼠的原代骨髓细胞或DC2.4树突细胞分别在生理盐水、LPS或不同浓度ABP-50-FOS刺激下培养48 h，测定细胞培养上清液中IL-12p70的含量。表7结果表明，LPS能明显小鼠骨髓细胞和DC2.4树突状细胞分泌IL-12p70（P＜0.01）。ABP-50-FOS 50 mg·L-1对小鼠骨髓细胞分泌IL-12p70有促进作用（P＜0.05），ABP-50-FOS 10 和50 mg·L-1则能显著刺激DC2.4树突状细胞分泌IL-12p70（P＜0.01）。提示ABP-50-FOS具有活化树突状细胞的作用。

Tab.7 Effect of ABP-50-FOS on IL-12p70 secretion of dendritic cells in BALB/c mice in vitro

3　讨论

牛膝是我国传统的常用中药材之一，具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经和引血下行等攻补兼具的作用，其中多糖可能是主要活性成分之一。近年来大量文献报道，牛膝粗多糖和果聚糖具有多种药理活性［14-15］，特别是在免疫调节和抗肿瘤方面［3，16］。时春娟等［17］对牛膝多糖结构修饰物（硫酸酯化、磷酸酯化、羧甲基化和羟甲基化）的抗肿瘤活性也进行了综述和评价，表明经过修饰后抗肿瘤活性进一步提高。文献中研究的牛膝多糖主要分为牛膝粗多糖和牛膝果聚糖（A.bidentata polyfructose，ABPS）。由于果糖是一种酮糖，经完全酸水解、硼氢化钠还原和乙酸酯衍生，最终为葡萄糖和甘露糖的乙酰化产物。早期文献报道，牛膝中葡甘寡糖（分子质量1400 u）具有显著的免疫调节活性［18-19］；之后田庚元等［13］再一次研究确证，该寡糖是由果糖和葡萄糖组成，二者摩尔比为8∶1。

巨噬细胞在体液免疫中不仅直接吞噬和杀伤病原体，还能介导炎症反应、加工和递呈抗原，分泌多种细胞因子启动免疫应答。TNF-α是巨噬细胞分泌的主要细胞因子之一，对B细胞和T细胞的激活有重要意义。树突状细胞同样在免疫应答中也至关重要，不仅向B细胞和T细胞递呈抗原，同时还参与固有免疫和T细胞亚群的分化。树突状细胞活化后分泌IL-12和NO，IL-12与NO结合，能刺激NK细胞的细胞毒性，促使释放IFN-γ，继而促进Th1淋巴细胞的分化［20］。Chen等［21］将ABPS分别按1000和1500 mg·kg-1剂量灌胃给予断奶乳猪14和28 d，能明显提高血清中IgG，IgM，IgA，IL-2和IFN-γ含量，呈时-效和量-效关系。Jin等［3］将ABPS按200 mg·kg-1剂量腹腔注射Lewis肺癌小鼠，在抑制肿瘤细胞生长的同时能上调脾细胞IL-6和TNF-α mRNA的表达。Zhu等［6］先给小鼠每天腹腔注射ABPS 50 mg·kg-1，连续15 d，然后感染约氏疟原虫（P.y）17XL株，发现ABPS能显著增强Th1反应，增加表达F4/80+CD36+的巨噬细胞数量以及IFN-γ，TNF-α和NO含量。更重要是ABPS能增加骨髓CD11c+CD11b+树突状细胞和浆细胞样CD11c+CD45R+/B220+树突状细胞的数量，促进CD11c+树突状细胞表达MHC-Ⅱ和CD86及TLR-9。Zou等［22］研究发现ABPS通过提高CD86，CD40和MHC-Ⅱ的表达而促进小鼠树突状细胞成熟，增强其抗原递呈能力和IL-12的分泌。吕建新等［23］研究了ABPS对人胸腔巨噬细胞的激活作用。结果表明，其能上调胸腔巨噬细胞内乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活性，并能显著诱导胸腔巨噬细胞表达TNF-α和IL-6。以上文献提示，ABPS能明显激活巨噬细胞和树突状细胞，促进成熟和抗原递呈相关分子和细胞因子的表达（但均未提及果聚糖的理化性质）。有文献报道，从其他植物中提取的果寡糖具有良好的免疫调节和抗肿瘤活性，如Kardošová等［24］从牛蒡根中分离一种分子质量为2950 u的果寡糖，连接方式为 1）-Fruf-（2 ，具有镇咳作用。Chandrashekar等［25］从大蒜（Allium sativum）中分离出2个分子质量分别＞3.5 ku和＜3.0 u的果聚糖（命名HF和LF），结构均为 1）-β-Fruf-（2 。HF和LF能促进小鼠淋巴细胞增殖，增强腹腔巨噬细胞吞噬能力。Chen等［26］从川牛膝（Cyathula officinalis）中分离一个分子质量1.4 ku的果寡糖CoPS3，结构为β-D-果寡糖骨架，同时还有1，2和1，6-果糖支链及葡萄糖末端。CoPS3具有良好的抗肿瘤活性，能抑制小鼠Lewis肺癌生长。Wu等［27］从沿阶草（Ophiopogon japonicus）根中分离一个分子质量为14 ku的果聚糖Opaw-2，骨架结构为β-（1 2）-Fruf和β-（2 6）-Fruf，还有β-（1 2）-Fruf支链，能在10～100 mg·L-1范围内浓度依赖性促进小鼠淋巴细胞的增殖。

本研究从怀牛膝中分离得到果寡糖ABP-50-FOS，研究其疫苗佐剂活性。该果寡糖能明显提高H1N1流感疫苗免疫小鼠血清中抗原特异性IgG，IgG1和IgM抗体水平，同时还能促进免疫小鼠脾T细胞及Th1和Th2细胞分化。体外实验表明，ABP-50-FOS能促进小鼠脾T和B细胞增殖及IFN-γ分泌，刺激腹腔巨噬细胞分泌TNF-α，促进树突状细胞活化和分泌IL-12p70。以上结果提示，牛膝果寡糖ABP-50-FOS能提高疫苗免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答能力，激活与抗原递呈密切相关的巨噬细胞和树突状细胞，对H1N1流感疫苗具有良好的疫苗佐剂活性。。其可能的作用机制有待进一步研究。

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Adjuvant effect of fructooligosaccharide from Achyranthes bidentata on H1N1 influenza vaccine and immunocyte function

WANG Yan-yan1，2，LI Hai-xia2，WU Ya-jun2，ZHAO Xiu-nan2，MA Hao2，LIU Kun-lu2，WU Jun-hua2，
SHAN Jun-jie2*，WANG Yu-xia2*，WANG Hai-nan1，3*
（1.College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，
China；3.China Food and Drug Administration，Beijing 100053，China）

OBJECTIVE To investigate chemical properties of a fructooligosaccharide（ABP-50-FOS）separated from Achyranthes bidentata and immune response in mice immunized H1N1 influenza vaccine.METHODS The methods of GPC，CE，IR and NMR were used to study chemical properties of ABP-50-FOS.BALB/c mice were immunized intramuscularly twice with H1N1 influenza vaccine （3 μg）plus ABP-50-FOS（200 μg）each mouse.The serum total antibody titer and its isotypes titers were analyzed by ELISA.The populations of CD4+，CD8+，CD3+and CD19+lymphocytes were determined by flow cytometry.The proliferation activities of spleen T and B lymphocytes were determined with MTT method.The levels of cytokines interferon-γ（IFN-γ），tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-4（IL-4），IL-12 and NO were measured by ELISA kits.RESULTS ABP-50-FOS was a fructooligosaccharide with moleculer mass 1885 u.Its bone linkages contained 1，2-and 1，6-fructose residues. ABP-50-FOS could induce high specific-IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b and IgM titers after immunization with H1N1 influenza antigen twice（P＜0.01）.ABP-50-FOS significantly elevated the percentage of CD3+，CD4+and CD8+spleen lymphocytes and IFN-γ secretions（P＜0.01）in vitro.It also stimulated peritoneal macrophage of mice and DC2.4 dendritic cells to produce TNF-α and IL-12p70 respectively （P＜0.01）.However，ABP-50-FOS inhibited secretions of NO in macrophage.CONCLUSION The fructooligosaccharide ABP-50-FOS separated from A.bidentata can exhibit strong adjuvant activity for H1N1 influenza vaccine.

Achyranthes bidentata；polysaccharide；fructooligosaccharide；vaccine；adjuvant

The project supported by National Key Technology R&D Program（2011BAD26B02-3）

SHAN Jun-jie，E-mail：shanjunjie0012@126.com；WANG Yu-xia，E-mail：wangyuxia1962@ hotmail.com，Tel：（010）66931645；WANG Hai-nan，E-mail：md_wanghainan@126.com，Tel：（010）88330710

R285.5

A

1000-3002（2016）02-0113-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.02.005

2015-08-31接受日期：2015-12-28）

（本文编辑：齐春会）

国家科技支撑计划课题（2011BAD26B02-3）

汪艳艳，女，硕士研究生，主要从事多糖化学及生物活性的研究。

单俊杰，E-mail：shanjunjie0012@126.com，王玉霞，E-mail：wangyuxia1962@hotmail.com，Tel：（010）66931645；王海南，E-mail：md_wanghainan@126.com，Tel：（010）88330710