二月兰籽水煎剂对白鲜皮所致小鼠急性肝损伤的保护作用

战奕巍，徐子茜，郭新慧，李荣佳，沈金平，许旭东，张宝旭（.北京大学公共卫生学院毒理学系，国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室，食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 009；.中国医学科学院药用植物研究所，北京 0093）

二月兰籽水煎剂对白鲜皮所致小鼠急性肝损伤的保护作用

战奕巍1，徐子茜1，郭新慧1，李荣佳1，沈金平1，许旭东2，张宝旭1
（1.北京大学公共卫生学院毒理学系，国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室，食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191；2.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193）

目的 研究新天然药物二月兰籽对传统中药白鲜皮所致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法 连续4 d，小鼠ig给予二月兰籽水煎剂36，54和72 g·kg-1。第4天给药后3 h，ig给予白鲜皮水煎剂70 g·kg-1，24 h后麻醉小鼠，内眦静脉取血，取肝组织。测定血清中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）和乳酸脱氢酶（LDH）的活性；测定肝组织中丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量，计算GSH/GSSG比值。肝组织病理切片，经HE染色后于光学显微镜下观察病理变化，并对病理图片进行坏死和变性组织面积半定量分析。结果 与正常对照组相比，白鲜皮模型组血清GPT，GOT和LDH活性分别升高500，140和40倍（P＜0.01）；二月兰籽水煎剂能明显降低白鲜皮水煎剂引起的血清GPT，GOT和LDH活性的升高（P＜0.05，P＜0.01），其中二月兰籽水煎剂36，54和72 g·kg-1组血清GPT水平分别下降62%，75%和99%，GOT水平分别下降70%，82%和98%，LDH水平分别下降55%，75%和96%。白鲜皮模型组肝组织MDA含量为（1.39±0.58）μmol·g-1组织，较正常对照组升高近10倍（P＜0.01）；GSH/GSSG比值为3.53±1.27，较正常对照组下降约40%（P＜0.01）；二月兰籽72 g·kg-1组肝组织MDA含量为（1.09± 0.29）μmol·g-1组织，较白鲜皮模型组下降22%（P＜0.05）；二月兰籽水煎剂组GSH/GSSG比值较白鲜皮模型组分别升高47%，42%和54%（P＜0.05）。对各组肝组织进行病理检查，正常对照组和二月兰籽水煎剂72 g·kg-1组未见明显肝损伤，白鲜皮模型组肝损伤面积达总面积的（64.1±8.5）%，二月兰籽水煎剂36和54 g·kg-1组肝组织损伤面积均较白鲜皮模型组减少，分别为（37.5±7.1）%和（20.0±0.8）%（P＜0.01）。结论二月兰籽水煎剂对白鲜皮所致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用。

二月兰籽；白鲜皮；急性肝毒性

我国药品注册管理办法中规定天然药物是指在现代医药理论指导下使用的天然药用物质、新发现的药材及其制剂。二月兰（Orychophragmus violaceus，OV）是一种十字花科诸葛菜属植物，也称为诸葛菜和二月蓝；OV的嫩茎叶用开水煮后，再放入冷水中浸泡，直至无苦味时便可炒食；种子可榨油［1］。OV是一种在北京被广泛种植的观赏植物［2］。近年来，人们对OV的开发兴趣不断高涨，特别是对其油脂成分、营养成分、维生素和矿物质以及水溶性成分等进行了比较深入的研究［3-6］，认为可能是一种具有发展前景的野生植物资源。但是，对OV的药用价值的研究还没有报道。为了探讨它的天然药物活性，我们对其肝病的治疗作用进行了系列研究，发现OV水煎剂对四氯化碳、二甲基甲酰胺、对乙酰氨基酚和二甲基亚硝胺等化学物质引起的急性肝损伤具有较好的保护作用，同时对白鲜皮所致小鼠急性肝损伤也具有保护作用。

芸香科（白鲜皮，Cortex Dictamni）是一种为我国历代药典收载的传统中药［7］，具有清热燥湿、祛风解毒及止痒等功效［8］，但是近年来，包括笔者实验室在动物体内外实验中发现，白鲜皮会造成动物肝损伤，其中的成分白鲜碱对肝细胞HepG2具有毒性作用［9］。2008年，含有白鲜皮成分的痔血胶囊因其严重的肝毒性被中国国家食品药品监督管理局召回。Wang等［10］在对白鲜皮的水提物进行亚慢性毒性作用研究后发现，在单独长期饮用白鲜皮水煎剂的情况下会引起明显的肝损伤。为避免因服用白鲜皮而造成的肝损伤，必须研制其肝毒性的解毒剂，同时也希望以后可按传统中药的配伍减毒理论来进行减毒研究。

1　材料与方法

1.1试剂和主要仪器

新天然药物OV籽产自北京，传统中药白鲜皮购于北京市中林花木绿化公司，均由北京大学医学部公共卫生学院张宝旭教授鉴定，标本保存于北京大学公共卫生学院毒理系研究室标本室。二者均采取水提法制备水煎剂，ig给药。取OV籽180 g，于2000 mL蒸馏水中煎煮，沸腾后30 min用16层纱布过滤；再重复2次；取3次滤液共6000 mL经加热浓缩至100 mL，制得OV籽水煎剂，每1 mL水煎剂相当于生药量1.8 g。取传统中药白鲜皮100 g，于1000 mL蒸馏水中煎煮，沸腾后30 min用16层纱布过滤；再重复2次；取3次滤液共3000 mL经加热浓缩至50 mL，制得白鲜皮水煎剂，每1 mL水煎剂相当于生药量2 g。

十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS），上海化学试剂厂；硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA），上海Aladdin公司；还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）试剂盒，德国Darmstadt公司；谷丙转氨酶（glutamate pyruvate transaminase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）自动生化仪试剂盒，四川迈克公司。

ARA520型电子精密天平，美国OHAUS公司；TDL-5-A台式离心机，上海安亭科学仪器厂；HITACHI-7170A型全自动生化分析仪，日本Hitachi公司；XHF-1内切式匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；722 s可见光分光光度计，上海棱光技术有限公司；850型荧光分光光度计，日本日立公司；LEICA病理切片机，日本LEICA公司；E400显微镜系统及DXM 1200F照相系统，日本Nikon公司。

1.2实验动物和分组

ICR小鼠，清洁级，雄性，体质量18～22 g，由北京大学医学部实验动物科技部提供。饲养条件符合实验动物福利伦理委员会的要求，并由北京大学医学部实验动物科技部提供动物用饲料，自由饮水。动物饲养环境温度22～24℃，湿度40%～60%，明暗周期12 h/12 h，自由通风。

25只小鼠随机分为5组，即正常对照组、白鲜皮模型组〔白鲜皮水煎剂（2 kg·L-1）给药体积为35 mL·kg-1，相当于生药剂量70 g·kg-1〕和OV籽水煎剂3个剂量组〔OV籽水煎剂（1.8 kg·L-1）给药体积分别为20，30和40 mL·kg-1，相当于生药剂量36，54和72 g·kg-1〕。OV籽水煎剂组ig给药，每天1次，连续4 d。第4天给药后3 h，ig给予白鲜皮水煎剂染毒；正常对照组ig给予等体积蒸馏水。24 h后，麻醉小鼠，内眦静脉取血，取肝，用预冷的生理盐水清洗，滤纸吸干称重，并肉眼观察肝大体变化。

因此初步判断高压油泵运行时出口压力与高压油泵出口开关整定值及返回值较为接近，在高压油泵运行压力出现一定波动或者高压油泵出口开关整定值出现一定漂移时，就会导致高压油泵出现自动切换等情况。

1.3生化指标测定

全自动生化分析仪测定血清中GPT和GOT活性及LDH含量。TBA反应法检测肝组织丙二醛（malondialehyde，MDA）含量［11］，肝组织MDA含量（mmol·g-1）=（样品吸光度-空白吸光度）/（四乙氧基丙烷标准品吸光度-空白吸光度）×四乙氧基丙烷标准品浓度（mmol·L-1）×样品稀释倍数。改良Hisson法测定肝组织中GSH和GSSG的含量［12］，肝组织GSH（GSSG）含量（mg·g-1）=（样品吸光度-空白吸光度）/〔GSH（GSSG）标准品吸光度-空白吸光度〕×GSH（GSSG）标准品浓度（mg·L-1）×样品稀释倍数；然后计算GSH/GSSG比值。

1.4HE染色观察肝组织病理变化

4%甲醛固定小鼠肝左叶，组织病理切片和HE染色之后，光学显微镜下用计算机电子照相系统拍照，Photoshop 7.0图像处理软件对病理图进行坏死和变性组织面积半定量分析［13］。肝组织损伤百分比（%）=肝组织损伤面积（像素）/拍照总面积（像素）×100%。

1.5统计学分析

2　结果

2.1二月兰籽水煎剂对白鲜皮所致急性肝损伤小鼠血清GPT，GOT及LDH的影响

由表1结果可见，与正常对照组相比，小鼠ig给予白鲜皮水煎剂70 g·kg-1后，血清中GPT，GOT和LDH水平分别升高500，140和40倍（P＜0.01），说明白鲜皮70 g·kg-1能明显引起肝急性损伤。

与白鲜皮模型组相比，OV籽水煎剂各剂量36，54和72 g·kg-1组小鼠血清中GPT，GOT和LDH的含量均明显下降（P＜0.05，P＜0.01），且随着给药剂量的增加，小鼠血清中GPT，GOT和LDH的下降也随之增加，其中GPT含量分别下降62%，75%和99%；GOT含量分别下降70%，82%和98%；LDH含量分别下降55%，75%和96%。说明OV籽水煎剂能明显缓解白鲜皮引起的急性肝损伤。2.2 二月兰籽水煎剂对白鲜皮所致急性肝损伤小鼠肝组织MDA含量及GSH/GSSG比值的影响

Tab.1 Effect of O.volaceus（OV）seed on serum glutamate pyruvate transaminase（GPT），glutamic oxaloacetic transaminase（GOT）and lactate dehydrogenase（LDH）levels in mice with acute liver injury induced by Cortex Dictamni

由表2结果可见，与正常对照组相比，白鲜皮模型组小鼠肝组织MDA含量升高了约10倍（P＜0.01），说明脂质过氧化程度加重；GSH/GSSG比值下降了40%（P＜0.01），说明谷胱甘肽消耗增多，白鲜皮可能是通过氧化损伤作用引起肝毒性。

OV籽水煎剂36和54 g·kg-1组MDA含量较白鲜皮组有所升高，72 g·kg-1组MDA含量下降了22%（P＜0.05）。说明OV籽水煎剂72 g·kg-1是通过抗氧化损伤作用对白鲜皮所致的小鼠急性肝毒性进行保护。

与白鲜皮模型组相比，OV籽水煎剂各剂量组GSH/GSSG比值分别升高47%，42%和54%（P＜0.01），说明OV籽通过抗氧化损伤作用对白鲜皮引起的小鼠急性肝毒性具有保护作用。

Tab.2 Effect of OV seed on malondialdehyde（MDA）and glutathione/oxidized glutathione（GSH/GSSG）ratio in liver tissue of mice with acute liver injury induced by Cortex Dictamni

2.3二月兰籽水煎剂对白鲜皮所致急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响

肉眼观察发现，正常对照组肝颜色暗红，被膜光滑完整，肝湿润，有光泽和弹性，无淤血和出血点。白鲜皮模型组肝颜色发黄或浅白，质地较脆，表面无光泽，可见出血点和坏死。与白鲜皮模型组相比较，OV籽水煎剂各剂量组肝病变明显减轻，颜色较红润，且随着OV籽水煎剂给药剂量的增加，肝病变明显减少，肝外观趋于正常。

HE染色发现（图1），正常对照组肝组织细胞结构清晰，包膜完整，细胞核大而清晰，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状整齐排列。肝细胞无坏死、变性，无炎性细胞浸润。白鲜皮模型组肝组织以中央静脉为中心，肝细胞不同程度坏死或水肿，肝细胞正常结构被破坏，肝细胞界限不清楚，胞质深染，细胞核固缩或裂解，炎性细胞浸润，肝细胞索排列紊乱，肝组织损伤严重。与白鲜皮模型组相比较，OV籽水煎剂各剂量组肝组织细胞及结构破坏程度明显减轻，肝细胞变性坏死明显减少，且随着OV籽水煎剂给药剂量的增加，肝组织病变进一步减轻；其中OV籽水煎剂高剂量组肝损伤程度最小。

表3结果表明，正常对照组和OV籽水煎剂72 g·kg-1组未见明显病理损伤，白鲜皮模型组肝组织损伤面积最大，占总面积的（64.1±8.5）%；OV籽水煎剂各剂量组随着给药剂量的增加，损伤面积逐渐减小（P＜0.01）。说明OV籽水煎剂明显缓解了白鲜皮水煎剂导致的急性肝损伤，且随着OV籽水煎剂给药剂量的增加，肝损伤程度逐渐减小。

Fig.1 Effect of OV seed on liver of mice with acute liver injury induced by Cortex Dictamni（HE staining×200）. See Tab.1 for the mouse treatment.The black arrow shows the necrotichepatocyte；The　red　arrow　showsthe　infiltrative inflammatory cells.

Tab.3 Effect of OV seed on liver damage proportion of mice with acute liver injury induced by Cortex Dictamni

3　讨论

GPT，GOT和LDH是评估肝损伤的常用指标，通常其值的升高能说明药物对肝产生了毒性作用，引起了肝损伤。本研究中，与正常对照组相比较，白鲜皮模型组小鼠ig给予白鲜皮水煎剂24 h后，其血清GPT，GOT和LDH水平均明显升高，说明白鲜皮对肝造成了明显的毒性作用，引起了肝损伤。由此可推断，白鲜皮水煎剂对小鼠造成急性肝损伤。与白鲜皮模型组相比，给予OV籽水煎剂的小鼠，在ig给予白鲜皮水煎剂24 h后，其血清GPT，GOT和LDH含量明显降低，且随着OV籽水煎剂浓度的升高，降低程度越明显，说明OV籽水煎剂对于白鲜皮造成的急性肝损伤具有一定的保护作用。

MDA是一种可反映脂质过氧化程度的物质，是一种监测机体氧化应激情况的生物标志物［14］，实验中经常通过测定肝组织匀浆中MDA的含量来判定肝的脂质过氧化程度。GSH/GSSG比值也是一种反映机体抗氧化损伤能力的指标［15］。为了初步探讨白鲜皮的肝毒性作用机制及OV籽抗白鲜皮肝损伤的保肝作用机制，检测了肝组织MDA的含量及GSH/GSSG比值。与正常对照组相比，白鲜皮模型组肝组织MDA含量明显升高，GSH/GSSG比值明显降低，说明白鲜皮可能是通过造成氧化损伤引起的肝毒性。与白鲜皮模型组相比，OV籽水煎剂36和54 g·kg-1组MDA含量升高，OV籽水煎剂72 g·kg-1组MDA含量下降，推测在给药剂量较低的时候，OV籽水煎剂可能是通过抗氧化损伤以外的方式发挥的保肝作用；而在给药剂量达到一定程度时，OV籽水煎剂的抗氧化损伤作用才明显表现。同时，与正常对照组相比，白鲜皮模型组GSH/ GSSG比值明显下降；与白鲜皮模型组相比，OV籽水煎剂各剂量组GSH/GSSG比值均有所升高，说明OV籽很可能是通过抗氧化损伤作用对白鲜皮所致的小鼠急性肝毒性发挥保护作用。

同时，本研究还对实验小鼠肝组织病理形态进行观察。与正常对照组相比，白鲜皮模型组小鼠肝出现了明显坏死，坏死面积超过一半；与白鲜皮模型组相比，OV籽水煎剂各剂量组的小鼠肝坏死程度随着给药剂量的增加逐渐减轻，坏死面积也逐渐减少，OV籽水煎剂高剂量组未见明显肝损伤。这进一步表明OV籽对白鲜皮造成的急性肝损伤具有保护作用。

综上所述，本研究通过动物实验发现，过度服用白鲜皮会引起急性肝损伤，而在同时服用OV籽水煎剂的情况下可明显缓解这种急性肝毒性作用。同时，还提出了白鲜皮肝毒性的可能机制及OV籽抗白鲜皮肝毒性的解毒机制，这为OV籽成为一种新天然药物并作为白鲜皮肝毒性的解毒剂提供了科学依据。但是，由于实验器材的限制，本研究并未对白藓皮中的具体有毒成分以及OV籽中的有效成分进行进一步研究，希望能由此引起广大研究者的关注，一起致力于中药配伍减毒的研究当中。

致谢：感谢贾凤兰老师和阮明老师对本研究的指导，感谢李园利女士对本研究提供的帮助。

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Protective effect of Orychophragmus violaceus seed against acute liver injury induced by Cortex Dictamni in mice

ZHAN Yi-wei1，XU Zi-qian1，GUO Xin-hui1，LI Rong-jia1，SHEN Jin-ping1，
XU Xu-dong2，ZHANG Bao-xu1
（1.State Key Laboratory of Detoxification Compatibility，Department of Toxicology，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China；2.Institute of Medicinal Plant
Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，China）

OBJECTIVE To study the protective effect of Orychophragmus violaceus（OV）seedagainst acute hepatotoxicity induced by the traditional Chinese Medicine Cortex Dictamni in mice. METHODS Twenty-five mice were randomly divided into 5 groups：control group，Cortex Dictamni group（70 g·kg-1）and OV seed groups（36，54 and 72 g·kg-1）.OV Seed groups were orally administered with the aqueous extract of OV seed for 4 consecutive days while the other groups were ig given water.On the 4th day，Cortex Dictamni group and OV seed groups were ig given the aqueous extract of Cortex Dictamni，and normal control group was ig given water.Twenty-four hours later，all the mice had their blood and liver samples taken after anesthesia.The serum chemical parameters were measured，including glutamic oxaloacetic transaminase（GOT），glutamate pyruvate transaminase（GPT）and lactate dehydrogenase（LDH），as well as malondialdehyde（MDA），glutathione（GSH）and oxidized glutathione（GSSG）levels in the liver.GSH/GSSG ratio was calculated.Histopathologic changes in the liver were observed and the area was calculated after HE staining.RESULTS Compared with normal control group，Cortex Dictamni（70 g·kg-1）increased the serum GOT，GPT and LDH levels by 500，140 and 40 fold（P＜0.01）.OV seed reduced serum GOT，GPT and LDH levels increased by Cortex Dictamni（P＜0.05，P＜0.01），by as much as 62%，75%and 99%for GPT，70%，82%and 98%for GOT，and 55%，75%and 96%for LDH，respectively.The level of MDA and the ratio of GSH/GSSG in Cortex Dictamni group were 1.39±0.58 and（3.53±1.27）μmol·g-1，a 10-fold increase and 40%decline compared with normal control group（P＜0.01）.OV seed of 72 g·kg-1lowered the level of MDA by 22% （P＜0.05），and OV seed（36，54 and 72 g·kg-1）increased the GSH/GSSG ratio by 47%，42%and 54% （P＜0.05）.Histopathologic results showed that OV seed alleviated the liver damage induced by Cortex Dictamni from（64.1±8.5）%to（37.5±7.1）%and（20.0±0.8）%（P＜0.01）.CONCLUSION OV seed can effectively protect mice from the acute hepatotoxicity induced by Cortex Dictamni.

Orychophragmus violaceus seed；Cortex Dictamni；acute hepatotoxicity

The project supported by National Science and Technology Major Project（2012ZX09301002-001-028）Corresponding author：ZHANG Bao-xu，Tel：（010）82801527，E-mail：bxzhang@bjmu.edu.cn

R285.5

A

1000-3002（2016）02-0101-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.02.003

2015-11-17接受日期：2016-02-01）

（本文编辑：贺云霞）

国家科技重大专项（2012ZX09301002-001-028）作者简介：战奕巍，女，硕士，主要从事毒理学研究，E-mail：zhanev@126.com；张宝旭，男，博士，教授，主要从事毒理学研究。

张宝旭，E-mail：bxzhang@bjmu.edu.cn，Tel：（010）82801527