黄芪对大鼠视网膜缺血再灌注损伤中HIF-1α 和VEGF表达的影响

贾茜钰　刘勤　白慧玲　董文

·临床研究·

黄芪对大鼠视网膜缺血再灌注损伤中HIF-1α 和VEGF表达的影响

贾茜钰刘勤白慧玲董文

目的：研究中药黄芪对不同时间段大鼠视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）实验过程中缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：将78只SD大鼠分为正常组、黄芪组和缺血再灌注组，前房加压法造模，黄芪组及缺血再灌注组分为6h、12h、24h、48h、3d和7d以上6各时间段处死大鼠，取材，行免疫组织化学法测定大鼠视网膜缺血再灌注损伤后大鼠视网膜中HIF-1α和VEGF表达的变化。结果：正常组大鼠视网膜中均未观察到HIF-1α和VEGF的表达，缺血再灌注组6只中均可检测到HIF-1α的表达，缺血再灌注6h即可检测到HIF-1α表达，24h达到相对高峰，黄芪组各时间段表达低于缺血再灌注组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。缺血再灌注后12h后缺血再灌注组和黄芪组开始出现VEGF的表达，48h达到高峰。各时间点黄芪组VEGF表达水平明显低于缺血再灌注组视网膜中VEGF表达水平，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：中药黄芪能改善对视网膜缺血再灌注损伤所致的相关缺血缺氧损害，可能通过抑制RIRI后视网膜中HIF-1α与VEGF的表达为主要机制，缺氧诱导因子-1α与内皮生长因子的表达率均随着RIRI时间的推移而表达升高，HIF-1α可能通过上调VEGF的蛋白表达，它们共同参与了损伤视网膜缺血再灌注的发生以及发展。

黄芪；大鼠视网膜；缺血再灌注损伤；HIF-1α；VEGF

视网膜缺血再灌注损伤（retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI）主要发生在青光眼、缺血性视神经病变、增值性视网膜病变、视网膜血管性疾病、新生儿视网膜病变等眼部疾病，是眼科临床诊疗工作中常见的视网膜病理过程，视网膜缺血再灌注损伤的发生机制尚不完全清楚，但研究表明可能与众多因素密切相关［1］。现代药理研究表明中药黄芪［2］对各个器官组织细胞的缺血、缺氧损伤具有保护作用，如肝脏缺血再灌注、心肌缺血再灌注损伤等。研究表明黄芪还可以通过营养相关神经组织抑制缺氧缺血，缺氧诱导因子-1 （hypoxia inducible factor 1，HIF-1）是缺氧诱导因子的细胞核提取物中存在的DNA结合蛋白，是能够反映缺氧调节的重要因子并能抑制细胞的生长，在缺氧的条件下可诱导相关细胞凋亡［3］。HIF-1α通过介导和调控相关转录因子从而适应机体组织的缺氧调节，缺血缺氧所导致的新生血管形成主要原因为氧化应激反应［4］。血管内皮生长因子（VEGF）是目前促进血管生成的最重要因子之一，在缺氧缺血诱导的新生血管生成中起重要作用［5］。本实验通过建立SD大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型，观察视网膜中缺氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子的相关表达，探讨中药黄芪对RIRI的保护作用。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组实验动物选用健康成年、裂隙灯下检查眼前节均正常SD大鼠78只，雌雄各半，体重（220±20）g［由甘肃中医药大学实验动物中心提供动物，合格证号：SCXK（甘）2011-0001C］。正常对照组6只（无任何处理，每个时间点直接处死）；其余72只大鼠按随机数字表法分为2组:黄芪组36只，RIRI造模前7d开始黄芪注射液（神威药业有限公司、10mg），6g/kg进行腹腔注射，每日1次，直至处死；缺血再灌注组36只，RIRI造模前7d开始同等体积生理盐水进行腹腔注射，每日1次，直至处死；按缺血再灌注时间将黄芪组和缺血再灌注组分为6 h、12 h、24 h、48 h、3d和7 d组，每小组6只。

1.2实验方法

1.2.1大鼠视网膜缺血再灌注模型的建立。实验模型采用大鼠眼球前房内生理盐水灌注法［6］。每只SD大鼠称重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠至睡眠状态，后将大鼠取俯卧位鼠台上固定后，1%丁卡因滴眼液点眼进行双眼局部麻醉，复方托吡卡胺滴眼液进行大鼠双眼散瞳，生理盐水冲洗双眼结膜囊，生理盐水瓶输液管连接7号头皮针，沿大鼠颞侧眼角巩膜缘将头皮针针头刺入大鼠眼球前房（应注意眼球前房刺入时应避免虹膜、晶状体的损伤），为固定针头用医用胶布粘于大鼠眼球同侧耳缘处。慢慢升高生理盐水输液瓶的高度直至输液瓶与大鼠眼球垂直距离为150cm，输液瓶与大鼠眼球高度至150cm可使大鼠眼内压升高至110mmHg（1mmHg=0.133 kPa），可观察到大鼠球结膜、虹膜渐渐变白，输液瓶与大鼠眼球高度至150cm时大鼠眼球结膜及虹膜为苍白改变，直接眼底镜可观察到大鼠视网膜颜色苍白，表明大鼠供给视网膜血流的视网膜中央动脉的阻断。1h后将生理盐水输液瓶高度缓慢降与大鼠眼球水平状态，继而关闭输液器开关，拔出输液针头，造模期间妥布霉素滴眼液频繁点眼以预防感染并保持角膜湿润，拔出针头后观察到球结膜以及虹膜颜色由苍白恢复正常，直接眼底镜下可见大鼠视网膜变为橘红色，表明大鼠视网膜的缺血动脉为重新开放，红霉素眼膏涂双眼结膜囊，造模完毕，等待大鼠清醒后回笼。

1.2.2标本取材、固定及切片。不同时间段各组大鼠腹腔注射过量水合氯醛处死后，立即摘除眼球，大鼠眼视神经可保留0.5～1.0mm，随后将眼球置于4%多聚甲醛内常温固定24 h，去除眼前节，剥离视网膜，常规脱水、透明、浸蜡，制成石蜡切片，常规石蜡包埋。

1.2.3免疫组织化学检测。每个组织块均取3μm的切片用于免疫组化染色。将3μm的切片常规脱蜡至水，加入3%H2O2，95℃微波10分钟将抗原修复，加入兔抗鼠HIF-lα（1∶300）抗体一抗（美国immnunoway公司），以0.1 mol/L的PBS代替一抗作为阴性对照。温度保持4℃过夜，PBS缓冲液冲洗，滴加生物素标记二抗，37℃孵育30分钟，PBS缓冲液冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30分钟，PBS缓冲液冲洗，二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）显色，自来水冲洗，苏木精复染1min，脱水透明后封片处理，观察并采集图像。血管内皮生长因子（VEGF）免疫组化检测滴加（1∶200）一抗-小鼠抗大鼠VEGF单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），其余步骤同HIF-lα。

1.2.4计算机图像分析。切片组织中细胞（细胞核、细胞质或细胞膜）显示出较多棕黄色颗粒为阳性表达，无棕黄色颗粒显现则为阴性表达。应用Image-Pro Plus图像分析软件计算阳性细胞的平均吸光度，旧称光密度（OD），每张切片随机取3个视野。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计分析，实验测试指标的数据资料以平均数±标准差（±s）表示，对各组视网膜平均光密度值（A值）进行单因素方差分析并进行两两比较。

2　结果

2.1视网膜中HIF-1α蛋白的表达正常组未能检测到HIF-1α的表达（图1）。缺血再灌注组HIF-1α在再灌注后6h开始出现阳性表达，在24h表达最强，主要在视网膜神经节细胞层表达（图2）。黄芪组HIF-1α的表达变化规律同缺血再灌注组，但是6组时间点HIF-1α的表达量均低于缺血再灌注组（图3）。视网膜缺血再灌注各时段HIF-Ia蛋白IOD值，见表1。

2.2视网膜中VEGF蛋白的表达正常组及缺血再灌注组、黄芪组缺血再灌注后6h均未见VEGF的表达（图4），缺血再灌注组在再灌注后12h主要在视锥视杆细胞层、INL和RGCs层开始出现VEGF的表达，表达逐渐增加，RIRI后48h表达达到高峰（图5），继而血管内皮生长因子的表达渐弱，7d时仍可检测到VEGF的表达。除RIRI后6h外，其余各个时间点黄芪组VEGF蛋白的表达均较缺血再灌注组明显减弱（图6）。表2为每组RIRI各时段VEGF蛋白的平均光密度（IOD）的变化，缺血再灌注组和黄芪组与正常组比较差异均有统计学意义。

图1　正常组未见HIF-1α（×400）

图2　缺血再灌注组可见HIF-1α（×400）

图3　黄芪组HIF-1α表达减弱（×400）

表1　视网膜缺血再灌注各时段HIF-1α蛋白平均IOD值的变化（±s）

表1　视网膜缺血再灌注各时段HIF-1α蛋白平均IOD值的变化（±s）

注:与正常组比较bP＜0.05；与缺血再灌注组比较aP＜0.05

组别　n　6h　12h　24h　48h　3d　7d正常组　6　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03缺血再灌注组　6　0.172±0.03b　0.311±0.04b　0.361±0.04b　0.320±0.05b　0.252±0.04b　0.224±0.03b黄芪组　6　0.121±0.03ba　0.200±0.04ba　0.301±0.03ba　0.240±0.04ba　0.199±0.03ba　0.184±0.04ba

图4　正常组未见VEGF表达（×400）

图5　缺血再灌注组VEGF强阳性表达（×400）

图6　黄芪组VEGF阳性表达明显减弱（×400）

表2　视网膜缺血再灌注各时段VEGF蛋白平均IOD值的变化（±s）

表2　视网膜缺血再灌注各时段VEGF蛋白平均IOD值的变化（±s）

注:与正常组比较bP＜0.05；与缺血再灌注组比较aP＜0.05

组别　n　6h　12h　24h　48h　3d　7d正常组　6　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03缺血再灌注组　6　0.075±0.04b　0.219±0.05b　0.420±0.06b　0.510±0.06b　0.320±0.06b　0.220±0.05b黄芪组　6　0.072±0.04ba　0.189±0.04ba　0.280±0.05ba　0.349±0.06ba　0.219±0.04ba　0.151±0.04ba

3　讨论

视网膜缺血再灌注损伤是眼科临床常见的疾病，如青光眼、缺血性视神经病变、增值性视网膜病变、视网膜血管性疾病、新生儿视网膜病变等眼部疾病。青光眼发病后能造成眼组织，特别是视网膜的损伤，关于高眼压造成视网膜、视神经等组织损伤的机理有较多研究，循环障碍和轴浆流学说得到较多的支持，近年来自由基学说对各种疾病的病理生理过程的研究起到重要作用。急性高眼压时视网膜氧分压降低、缺血、缺氧，导致了一系列的代谢障碍及病理学改变。视网膜血管性疾病中视网膜中央动脉阻塞通常发生于视乳头巩膜筛板或后部，少许也可以发生于筛板前，视网膜氧分压也降低，出现一系列的缺血缺氧病理状态。本实验运用大鼠前房生理盐水灌注法造成视网膜血管断流形成大鼠RIRI模型，实验中将输液瓶高度保持150cm从而形成14.63 kPa的压力能够造成大鼠视网膜血管断流，这与大鼠的体循环收缩压相接近，造模成功后应用免疫组化方法检测RIRI后视网膜HIF-1α及VEGF表达情况；探讨黄芪对HIF-1α和VEGF表达的影响。HIF-1α的靶基因产物如GLUTs-1、VEGF、HO-1、iNOS及编码p21、BcL-2等基因在相关肿瘤的细胞代谢、新生血管生成、肿瘤增殖和转移中也具有重要的作用。HIF-1α可调节VEGF表达从而促新生血管形成［7］。

中药黄芪作为祖国的传统中药，属补虚药中补气药，其有效成分有黄芪总黄酮、黄芪总皂甙、黄芪总多糖和胆碱等。近年来研究发现黄芪具有清除机体氧自由基代谢产物、改善记忆和保护大脑的作用。黄芪的有效成分黄芪总酮和黄芪总甙具有清除氧自由基和调控NO的作用，可防止生物膜的脂质过氧化，其中黄芪总酮的作用最为明显，是黄芪抗脂质过氧化的主要活性成分。在临床及科研上作用广泛，这与其药理作用有着密切的联系，而视网膜缺血再灌注由于自由基造成生物膜损伤，特别是线粒体肿胀，可致酶活性降低，氧化磷酸化受到抑制，能量产生障碍，进而使微粒体的多聚核蛋白体解聚脱落，抑制蛋白合成，溶解膜体受损［8］。黄芪中的主要成分黄芪多糖通过提高血中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽-过氧化物酶活力，来提高抗氧化能力。此外黄芪黄酮在体内也具有较好的抗氧化作用，相关研究［9］证实黄芪可以明显减轻视网膜内层水肿，可通过平衡钙离子稳态，减少神经型一氧化氮合成酶的激活，使体内一氧化氮的生成减少，调节脂质过氧化反应等，从而对RIRI后损伤具有保护作用。黄芪也可使神经节细胞中B-淋巴细胞瘤-2表达增强，B-淋巴细胞瘤-2家族成员之一Bax表达减弱，抑制视网膜神经节细胞凋亡对RIRI起到保护作用［10］。本研究结果显示，大鼠视网膜缺血再灌注损伤后缺氧诱导因子-1α在再灌注后6 h表达开始出现，在24h表达最强，之后开始下降。在RIRI后12h VEGF的表达开始增加并逐渐增强，再灌注损伤后48h达到峰值，之后开始下降。缺血再灌注组中HIF-1α和VEGF的表达明显高于正常组，黄芪组视网膜HIF-1α 和VEGF的表达明显低于缺血再灌注组，实验结果提示中药黄芪可以通过抑制RIRI中HIF-1α及VEGF的表达而发挥对视网膜的保护性作用，这可能和视网膜组织缺血缺氧时自由基大量产生，自由基与脂质、蛋白质的反应将造成多种生物膜损伤有关，诱导HIF-1α表达增加主要通过抑制HIF-1α降解途径，并非增加HIF-1α mRNA翻译，VEGF促进血管内皮细胞的分裂、移行，增加血管的通透性，使组织产生新生血管来缓解组织缺血缺氧。

本研究表明，视网膜缺血再灌注损伤的发生发展可能与HIF-1α通过上调VEGF蛋白表达相关联，黄芪可以通过抑制缺血视网膜组织中HIF-1α及VEGF的表达而对其起保护作用，但关于黄芪对HIF-1α及VEGF的具体细胞分子途径目前尚不完全清楚，有待进一步研究。

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［9］赵奎卿，贺经.黄芪对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的影响［J］.国际眼科杂志，2006，6（1）:1042-1044.

［10］高峰丽，戚雪.黄芪对大鼠视网膜缺血再灌注损伤中Bcl-2和Bax表达的影响［J］.国际眼科杂志，2012，12（5）:826-828.

A

1004-2725（2016）02-0105-04

730000甘肃 兰州，甘肃中医药大学中医临床学院（贾茜钰、董文）；730000甘肃 兰州，甘肃省人民医院眼科（刘勤、白慧玲）

刘勤，E-mail：summliu@126.com