响应面法优化蜂胶总黄酮的提取工艺

安砚波　王　浩（1山东医药技师学院，泰安271016；2泰山医学院药学院，泰安271016）

响应面法优化蜂胶总黄酮的提取工艺

安砚波王浩
（1山东医药技师学院，泰安271016；2泰山医学院药学院，泰安271016）

优化蜂胶总黄酮的提取工艺。方法：以蜂胶总黄酮提取得率为指标，通过响应面分析法优化蜂胶黄酮的提取工艺，并对最佳提取工艺进行验证。结果：蜂胶总黄酮提取的最佳工艺参数为：乙醇浓度72.48%，超声功率82.44%，超声时间25.11min，总黄酮的得率达到13.07%。结论响应面分析法可以很好地对蜂胶总黄酮提取工艺进行优化，对实际生产具有理论指导意义。

蜂胶；黄酮；响应面法

蜂胶（Propolis）是一种天然的活性物质，是蜜蜂从植物芽孢或树干采集的蜂蜜，混入蜜蜂上颌腺分泌物和蜂蜡后加工制成的芳香味的胶状固体物质［1］。蜂胶中含有丰富的黄酮类物质，如芸香苷、槲皮素、高良姜素、杨梅素、松属素、山奈酚、芹菜素等，约占总黄酮的20～30%［2］。蜂胶黄酮具有多种生物学活性，如抗炎、抗过敏、抗癌、抗病毒、抗增生、抗细胞分化、抗氧化清除氧自由基等，因此蜂胶成为一种具有很大开发潜力的天然中药材和天然保健食品［3-5］。

响应面法（Response Surface Method，RSM）是通过对响应曲面及等高线的分析寻求最优工艺参数，采用多元二次回归方程来拟合响应值与因素之间函数关系的一种优化统计方法［6-7］，其优点是在试验条件优化过程中可以连续地对试验因素的各个水平进行分析，所以广泛应用于试验设计与工艺优化研究［8-10］。本实验利用超声法提取蜂胶黄酮，并利用响应面法对其提取工艺进行了优化，以确定其较优的提取工艺条件。

1.材料

蜂胶原胶，由山东省实验种蜂场提供；芦丁标准品，购自中国药品生物制品检定所；三氯化铝；无水乙醇等均为国产分析纯；KQ-600DB型数控超声波清洗器（可控温），昆山市超声仪器有限公司；UV-2550紫外分光光度计，岛津制作所。

2.方法

2.1标准溶液的配制和标准曲线的制备

参照文献［11-12］，准确称取芦丁标准品0.0050g，用70%的乙醇溶液溶解并定容至25ml摇匀，取2.5ml该溶液用70%的乙醇定容至25ml，得质量浓度为0.0200mg/ml的芦丁标准液。分别取上述芦丁标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10 ml容量瓶中，加入70%乙醇稀释至5.0 ml。滴加10%AlCl3溶液0.1 ml，摇匀，用蒸馏水稀释至刻度，显色15 min，以空白试剂为参比液，于波长422 nm处测其吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方程为y=29.7x-0.0044（R2=0.9992）。

2.2蜂胶总黄酮含量的测定

以芦丁为参照测定蜂胶总黄酮含量。准确称取蜂胶总黄酮提取物0.5g于25ml容量瓶中，按一定的液固比（V/m）加入乙醇水溶液，超声一定时间，离心。上清液用70%乙醇水溶液定容，摇匀，准确吸取0.1ml置于试管中，在试管中加入0.1ml三氯化铝摇匀，在紫外分光光度计中测得吸光度，带入芦丁标准曲线方程中，计算可得蜂胶总黄酮的含量，即为得率。

3.结果和讨论

3.1方法学考察

3.1.1重现性实验 取2.2方法提取的样品重复测定5次，求得相对标准偏差（RSD）为1.02%。

3.1.2稳定性试验将2.2提取的样品每隔5min测定一次吸光度，求得RSD=0.26%，

3.1.3回收率试验精密称取5份蜂胶，分别加入芦丁标准品0.05mg按3.2所述制得样品液，测得加标平均回收率为112.6%，RSD为1.06%。

3.2单因素试验

3.2.1乙醇浓度对总黄酮得率的影响

图1为液固比20∶1、超声30min、功率70%、30℃的条件下，不同乙醇浓度对蜂胶总黄酮得率的影响。由图1可知，随着乙醇浓度的提高，蜂胶总黄酮得率呈上升趋势，当乙醇浓度达到70%时总黄酮得率最大，之后随着浓度的增加，得率反而降低。

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图1　乙醇浓度对总黄酮得率的影响

3.2.2超声时间对总黄酮得率的影响

图2为乙醇浓度70%、液固比20：1、功率70%、30℃的条件下，不同超声时间对总黄酮得率的影响。由图2可知，超声20～40min内总黄酮得率呈上升趋势，然后随时间的延长有所下降。因此，本实验选择超声时间为30min。

图2　超声时间对总黄酮得率的影响

3.2.3液固比对总黄酮得率的影响

图3为乙醇浓度70%、超声30min、功率70%、温度30℃的条件下，不同液固比对总黄酮得率的影响。由图3可知，蜂胶总黄酮得率随着溶剂量的增加而增加，在液固比达到15∶1后，总黄酮得率有所降低，由此确定蜂胶黄酮提取的液固比以15：1为宜。

图3　液固比对总黄酮得率的影响

3.2.4温度对总黄酮得率的影响

图4为乙醇浓度70%、超声30min、功率70%、液固比15∶1的条件下，不同温度对总黄酮得率的影响。由图4可知，蜂胶总黄酮得率随着温度的增加而增加，在温度达到60℃后，总黄酮得率有所降低，因此，本实验选择蜂胶黄酮提取温度为60℃。

图4　温度对总黄酮得率的影响

图5　功率对总黄酮得率的影响

3.2.5超生功率对总黄酮得率的影响

图5为乙醇浓度70%、超声30min、液固比15：1、温度60℃的条件下，不同功率对总黄酮得率的影响。由图5可知，蜂胶总黄酮得率随着功率的增大而增加，在功率达到70%后，总黄酮得率反而降低，由此确定蜂胶黄酮提取的功率宜设为70%。

3.3关键影响因素确定

3.4响应面法对蜂胶黄酮提取工艺优化

表1　Box-Behnken试验设计及相应值

3.4.1Box-Behnken设计方案及结果

由Box-Behnken设计方案所得的试验结果见表1。

经回归拟合后，得到以蜂胶总黄酮得率为响应值的回归方程为：Y=0.031+（8.750E-004）*X1+（6.250E-004）*X2+（-2.500E-004）*X3+（1.750E-003）*X1X2+（-5.000E-004）*X1X3+（-5.575E-003）*X12+（-1.075E-003）*X22+（1.175E-003）*X32

从表2的方差分析结果看，乙醇浓度的“Prob＞F”值大于0.05，表明其对总黄酮得率的影响不显著，超声功率的“Prob＞F”值大于0.05，表明其对总黄酮得率的影响不显著，超声时间的“Prob＞F”值大于0.05，表明其影响不显著。整体模型的“Prob＞F”值小于0.01，表明该二次方程模型高度显著；失拟项比F值为1.22，表明失拟项相对于绝对误差是不显著的，而不显著的失拟项才可取；决定系数为0.9430，表明其应变量与全体自变量之间的多元回归关系显著，即说明该回归方程对试验拟合情况较好，试验误差小，因此可用该回归方程对不同提取条件下的蜂胶总黄酮得率进行预测。

图6　乙醇浓度和功率对总黄酮得率的影响

图7　超声时间和功率对总黄酮得率的影响

表2　回归方程方差分析

响应面图形是响应值对各因素（X1、X2、X3）所构成的三维空间的曲面图，从图6、7上可形象的看出各因素交互作用对响应值的影响。比较图6、7可知，乙醇浓度对蜂胶总黄酮得率的影响最为显著，表现为曲线较陡，乙醇浓度最佳值在72%左右；而超声功率和超声时间次之，表现为曲线较为平滑，其最佳响应值分别在82%和25min左右。

3.4.2蜂胶总黄酮提取工艺条件的确定及验证

通过回归模型预测的蜂胶总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度72.48%，提取功率82.44%，超声时间25.11min，在此条件下，蜂胶总黄酮得率理论上可达13.20%。考虑到实际操作的可行性，将蜂胶总黄酮的提取条件在回归方程得到的理论值基础上修正为：乙醇浓度70%，液固比15∶1，超声功率80%，超声时间25min。以优化条件进行验证，共进行3次实验，验证实际平均值为13.07%，比优化前的蜂胶总黄酮得率11.39%提高了9%。实验验证值与预测值较为接近，证明响应面分析法得到蜂胶总黄酮提取条件真实可靠。

4.结论

将响应面分析应用于蜂胶总黄酮提取工艺的研究，采用合理的试验设计对提取工艺进行全面研究，依据回归分析确定各工艺条件的影响因子，从而确定蜂胶总黄酮提取的最佳条件为乙醇浓度72%，液固比15∶1，超声时间25min，超声功率82%，比优化前的蜂胶总黄酮得率提高了9%。利用此工艺既可缩短提取时间，又能节约成本，试验结果科学、可靠，为充分开发和利用蜂胶资源提供了科学依据。

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安砚波（1981-），男，助理讲师，研究方向：中药药理。

王浩（1977-），女，副教授，研究方向：药理学。