功能基因组学驱动蜜蜂系统生物学研究

刘振国王红芳王 颖郭兴启李兴安胥保华（山东农业大学动物科技学院，泰安708；山东农业大学生命科学学院，泰安708；吉林省养蜂科学研究所，吉林08）

功能基因组学驱动蜜蜂系统生物学研究

刘振国1王红芳1王 颖1郭兴启2李兴安3胥保华1
（1山东农业大学动物科技学院，泰安271018；2山东农业大学生命科学学院，泰安271018；3吉林省养蜂科学研究所，吉林132108）

在生命科学研究蓬勃发展的后基因组学时代，系统生物学已成为研究复杂生命现象的重要手段和研究热点。以高通量组学技术为技术平台，研究特定生理状态下大量基因、蛋白质或代谢产物等生物大分子的表达模式变化规律，有助于建立与生物表型变化的相关性，为探究生理过程的分子调节机制提供依据。本文总结了广泛应用的多种组学的研究进展，同时对该技术在蜜蜂领域的研究加以综述，为蜜蜂系统生物学研究提供重要参考资料。

蜜蜂；系统生物学；功能基因组学

系统生物学（systems biology）是研究生物系统中所有不同性质的组成成分（基因、mRNA、蛋白质、生物小分子等）的构成、以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。显然，系统生物学是以整体性研究为特征、以实现从基因序列到功能网络、到细胞、到组织、到个体的各个层次的整合为研究目标的综合学科，以期复杂的生理条件下可靠地反映出生物系统的真实性。然而，针对单一方向研究生命科学无法解释系统生物学问题，而以个体或群体为单位，针对生命过程中全部基因、蛋白质表达模式或产物代谢途径的组学研究应运而生。为基因组学研究提供了新的视点，极大地丰富了后基因组学方面的研究手段，使得系统生物学与细胞生物化学紧密联系在一起，揭示基因间、基因与环境互作关系，为阐明致病机制、遗传变异、进化过程等生物学所面临和亟待解决的问题提供大数据支持。

蜜蜂是重要的授粉昆虫和模式生物。近年来，生态环境复杂多变使得蜜蜂的生存面临严峻的考验，种群数量锐减危害了农作物生产和生态多样性［1］。资料显示，群体崩溃紊乱（Colony collapse disorder，CCD）导致美国蜂群2008年保有量较1947年骤降了近61%［2］，这一比例在2014年下降为42.1%，但其原因尚未清晰。蜜蜂的学习和记忆等生物行为学一直受到关注。蜜蜂的基因组测序完成［3，4］，促进了以高通量组学技术为手段的蜜蜂系统生物学研究，本文综述了近年来广泛应用的基因组学分析技术的研究进展及其在蜂学研究领域的应用。

1　基因组学研究方法

基因组（genome）是研究基因组及其功能的学科。如今涉及生命科学的研究大多是基于基因组学科之上而发展起来的，带动了该领域的研究在观念认识和技术方法上的飞跃。随着测序技术的不断进步，基因组学成果日新月异。以Roche公司的454测序平台、Illumina公司的Solexa测序系统以及ABI公司的SOLID测序系统为代表的新一代测序技术，降低测序成本的同时极大地提高了测序速度，拓展了基因测序的应用范围，尤其促进了系统生物学研究和分子诊断方法的革新。为基因组学、转录组学、宏基因组学研究等方面带来全新的变化，并逐步深入到微生物学研究领域中［5］，而在肠道微生物的研究中提出了宏基因组学（Megagenomics）和宏蛋白质组学（Metaproteomics）的概念［6］，摆脱了微生物培养技术瓶颈的局限性。而肠道微生物无论是从菌体数量还是编码基因数目上都远超机体本身，因此被认为是机体除自身基因组外的第二套基因组，其组分变化与疾病健康的关系等在研究中受到重视。肠道微生物在营养物质代谢、抵抗某些病原菌的侵袭和增强机体免疫力等方面具有重要作用［7］，为蜜蜂健康养殖、环境评价等提供了新思路［8］，极大地丰富了后基因组学方面的研究手段，使得系统生物学与细胞生物化学紧密联系在一起，揭示基因间、基因与环境互作关系，为阐明致病机制、遗传变异、进化过程等生物学所面临和亟待解决的问题提供大数据支持。

蜜蜂是典型的社会性昆虫，其高度组织、分工明确的社会形态是由染色体倍数和基因选择性表达所控制的。同时蜜蜂的智慧也常常令人感到惊叹，所以通过蜜蜂系统生物学的研究，不仅揭示了蜜蜂起源和进化的奥秘，同时也加深了对蜜蜂社会行为的理解。自2006年西方蜜蜂（Apis mellifera）全基因组测序公布以来，蜜蜂科学研究亦进入后基因组学时代，功能基因组学研究使得蜜蜂生命科学的研究逐步从单个基因扩大到全基因组的修饰、表达调控和功能研究，建立了生物大分子物质变化与机体表型之间的关联性，极大地促进了后基因组时代蜜蜂生理生化、营养需求、病虫害防治、健康福利等方面的研究，也为解决蜜蜂面临的诸多威胁制定防护策略。

功能基因组学（functional genomics）是确定基因组所有基因及其产物的生物学功能的科学［9］。随着测序技术的不断革新，目前涉及关键作物、畜禽、模式生物和灵长类等全基因组序列已测序完成并相继公布（表1），使得人们全面了解测序物种的基因结构组成、表达调控、进化变异等信息，极大地促进了系统生物学的深入研究，为解决全球粮食、能源及工业原料短缺问题、促进农业增产增效、加速新品种培养、制定疾病解决方案具有重要战略意义。

宏基因组学（Megagenomics）概念，使研究者们运用深度测序手段对特定环境中的微生物群落进行大规模分析，研究微生物群落多样性及评估其代谢功能［10，11］，以期探索微生物间、微生物与宿主间互利共生、相互竞争的动态平衡的复杂关系。美国科学院院士南希·莫兰（Nancy Moran）开辟了蜜蜂肠道微生物学的研究［12］，奠定了蜜蜂肠道微生物系统生物学研究的基础，研究发现，肠道微生物多样性的变化从营养代谢以及疾病免疫等多方面影响着传粉昆虫的健康状况和种群演化。

2　基因组学在蜜蜂系统生物学中的研究进展

2.1基因组学研究奠定了蜜蜂模式生物的地位

蜜蜂作为重要的授粉昆虫和模式生物，是继果蝇（Drosophila melanogaster）、蚊子（Anopheles gambiae）之后第三种全基因组被破译的昆虫，其基因组信息先后于2006年（意大利蜜蜂，A.mellifera）［3，13］和2014年（东方蜜蜂，A.cerana）［4］公布，发现蜜蜂（A.mellifera）具有的16对染色体中包含约2.6亿个碱基对（约为人类基因组的1/10），编码约1万个有效基因，比果蝇和蚊子的基因总数少30%左右。蜜蜂基因组约有170个与气味感受器有关的基因，是果蝇和按蚊的2倍；而与嗅觉感受器相关的基因只有10个，远不及果蝇的68个和按蚊的76个［14］，这与蜜蜂需要通过气味辨识敌我和寻找合适的花朵等行为有关。另外，蜜蜂拥有的个体免疫相关基因数量只有果蝇和蚊子的1/3［15］，但是它们有一套完整的被称之为“social immunity”［16］的协作性为抵御蜂巢内的病虫害，包括清洁巢房、梳理行为等［17］。另外，工蜂将具有抗菌功效的蜂胶涂抹在巢房内壁，导致蜜蜂免疫相关基因较少［18］。表皮碳水化合物合成系统、Notch信号通路相关基因被认为是蜜蜂抵御细菌侵染的有效基因［19，20］。

社会性的蜜蜂为研究神经科学、免疫学、行为学和进化学等提供良好的素材，是极高科研价值的模式生物。随着蜜蜂全基因组学研究的不断深入，基因功能和调控机制成为新的研究热点。在漫长的进化过程中，蜜蜂与其他物种一样，被不断选择演变，繁衍成昆虫纲中“高级进化”的类群，依赖的是群体行为学。Sarma等［21］以西方蜜蜂、大蜜蜂和小蜜蜂这3个蜂种中研究具有舞蹈行为的采集蜂中枢神经系统为研究对象，发现蘑菇体中基因表达差异极大，而中脑和次级胸神经节则表达一致性很高，多数与新陈代谢和能量供应有关。从差异表达基因反映了不同蜂种巢内活动、社会生态和舞蹈行为的差别，也解释了中脑和次级胸神经节在调节舞蹈行为中的作用方式，指出蘑菇体是控制学习、记忆和节律行为的重要组织。陈璇［22，23］对不同发育阶段的三型蜂的全基因组miRNA测序结果表明，在4个样本中ame-bantam、ame-mir-279c、ame-mir-750和amemir-14的表达量最高，预示这些miRNA可能在雌蜂L4和L5发育阶段的基本生命活动中至关重要，并得到免疫系统（ame-mir-14）、大脑相关功能发育（ame-mir-34和ame-mir-317）的miRNA表达，为研究miRNA对蜜蜂发育、级型分化提供依据。秦秋红［24］通过利用miRNA测序技术和Solexa数字基因表达标签分析技术（DGE）分析了迷宫视觉对东、西方蜜蜂miRNAs和mRNAs的表达影响，认为前者对颜色和光栅图形的学习与记忆能力均显著强于后者。研究发现处理组40差异表达的miRNAs和45个差异表达基因（共388个）上调表达；得到一些与神经学习记忆有关的miRNAs，如miR-124，let-7，miR-9a和mir-1000等，和差异表达mRNA，如GABAA beta、烟碱型乙酰胆碱受体、TWKSPDIVIRFa-containing神经肽和突触结合蛋白等，分析了MAPK/ERK途径对蜜蜂记忆中的作用，阐述了西方蜜蜂经迷宫视觉学习后大脑内miRNAs和mRNAs的表达量差异，为研究蜜蜂大脑学习记忆等神经功能奠定基础。

表1　基因组信息公布的主要物种①

2.2基因组学研究提供了蜜蜂进化水平的依据

基因组学是研究物种进化和分类的重要手段。一般认为蜜蜂起源于非洲［25］，可追溯到1亿年前的恐龙时代，但也有证据表明蜜蜂起源于30万年前的中亚。Wallberg等［26］通过研究世界各地14个居群的140种蜜蜂的SNP的遗传变异模式，结果显示蜜蜂具有高水平的遗传多样性，并对蜜蜂可能起源于亚洲这一观点提供了基因组序列进化树数据支持。此外，蜜蜂属9个种中，有8个种在东南亚地区仍然有繁盛的野生种群［27］。因此，该研究从进化和遗传适应性角度为蜜蜂研究提供了新的见解，为研究抗逆性和气候适应性的生物学机制提供分子基础，有助于制定全球范围内的蜜蜂保护策略。Pinto等［28］利用线粒体DNA tRNAleu-cox2和SNP测序数据分析了欧洲黑蜂保种群体的基因多态性和渗透水平，并与非保种群进行比较。研究发现，非保种群基因渗透率达30%，高于保种群的8%，反应出前者SNP变异程度较大，并认为SNP技术是检验保种群体的基因多态性有效手段。养蜂活动和贸易促进了地区间蜂种的基因交流等构建了“祖先信息标记”（AIMs，ancestry-informative markers）计算模式，包含Fst及其异值化检测、Delta值、In和PCA等参数，为研究欧洲蜂的品种鉴定和杂合水平提供依据，有助于制定蜜蜂保种规划。Chapman等［30］在非洲蜜蜂、东方蜜蜂、欧洲蜜蜂和西欧蜂种获得了95个差异的SNP，为检测蜂群中非洲蜜蜂血统所占比例和筛选优良生产性状的蜂种提供可靠依据。

2.3基因组学研究推动了蜜蜂健康养殖的发展

宏基因组在肠道微生物研究中的应用广泛。Cox-Foster等［31］运用基于16S rDNA和18S rDNA高通量焦磷酸技术的测序手段对世界范围内多个地区的蜜蜂肠道微生物进行研究，发现IAPV与CCD的发生甚为密切，后者在各地造成了不同程度的蜂群崩溃，严重威胁蜂业发展以及生态平衡。Cornman等［32］以西方蜜蜂白垩病的致病菌子囊球菌［33］（Ascosphaera apis）的转录组水平研究致病机理，通过454焦磷酸测序得到拼接成10，087条contigs，预测得到6，992个编码蛋白的基因，发现了一些编码毒力因子和水解酶（特别是几丁质酶），有助于病菌突破宿主的防御机制（如幼虫的食围膜和蛹期的角质层），最终使宿主致死。分析表明黄曲霉毒素-柄曲霉素（Aflotoxin-Sterigmatocystin，ST）合成通路中，AflR（AAPI16014）是调节AF/ST的转录，StcU/ Verl（AAPI15087）在曲霉菌的毒素合成中起重要作用。Aufauvre等［34］通过测定微孢子虫和杀虫剂对中肠转录组蜜蜂的影响，发现杀虫剂的长期作用没有显著影响解毒相关基因，但会抑制免疫相关基因的表达。微孢子虫的侵染会强烈的改变中肠的免疫水平和海藻糖含量。李继莲等［35］通过Roche 454高通量测序平台测定了分布在我国境内的青海、内蒙古、广西、四川、安徽等地区28种熊蜂的肠道细菌的16S的V6-V8区域，结果表明熊蜂肠道微生物存在两种保守的生态型：一种是由Gilliamella和Snodgrassella菌群组成，这两类菌群在蜜蜂中也存在；另一种生态型主要是由环境性菌群组成，而且含有一些条件致病菌如哈夫尼菌属（Hafnia）和沙雷氏菌属（Serratia）。这两种不同生态型在熊蜂肠道微生物中的出现显示出与哺乳动物肠道微生物生态型分化的高度一致，对于熊蜂物种的健康和种群动态具有潜在的影响，为进一步挖掘这些特定肠道共生菌的功能奠定基础，同时也为我国蜂种资源的多样性保护提供参考。

3　小结

功能基因组学研究已渗透到生命科学的众多领域，从肠道微生物组到传染性病毒，从发育生物学到癌症发生机制等多个方面，展现了蓬勃的生机及广泛的应用性，为系统生物学研究提供了强有力的工具。如今，高通量测序已从实验室进入了临床检验，借助分子标记物进行患病风险评估，做到有效的监测、预警和干预，蜜蜂研究中尚有诸多问题亟待解决。因此，将高通量组学技术运用到蜜蜂研究领域，有助于探索蜜蜂遗传因素与环境因素作用方式，促进抗病育种、发展健康养殖和保持物种多样性，对维持生态平衡具有重要意义。

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Functional genomics based application stimulate the future prospects in honeybee systems biology research

Liu Zhenguo1，Wang Hongfang1，Wang Ying1，Guo Xingqi2，Li Xing an3，Xu Baohua1
（1 College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China；2 College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China；3 Jilin Provincial Institute of Apicultural Science，Jilin 132108，China）

High-throughput studies of biological systems are rapidly accumulating a wealth of'omics'-scale data which have allowed researchers to better assess the complexity and diversity of the system biology in the post-genome era.Omics-based applications such as genome，transcriptome and proteome have been performed in various bioscientific researches for the integrated visualizations that give biological insight into the profiles of abundant of gene，protein and metabolite etc，well benefit the construction of the relationship between the traits and biomacromolecule as well as the molecular regulation mechanism of certain physiological processes.The current understanding and processing of widely used omics-based applications are summarized in this review，also with emphasis on its performance and achievement in honeybee research.

honeybee；systems biology；functional genomics

国家自然科学基金项目（No.31572470）；山东省农业良种工程项目“优质高产蜜蜂及蚕桑新品种培育”（2014-2016）；国家蜂产业技术体系建设专项资金（No.CARS-45）

刘振国（1984-），男，在站博士后，主要从事蜜蜂营养与分子生物学研究，E-mail：lzhenguo_001@163.com

胥保华（1965-），男，教授，主要从事蜜蜂营养与分子生物学研究，E-mail：bhxu@sdau.edu.cn