响应面法优化超声辅助提取豆豉低聚糖工艺

吉义平，陈　欣，沈瑞敏

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北武汉430205）

响应面法优化超声辅助提取豆豉低聚糖工艺

吉义平，陈欣，沈瑞敏

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北武汉430205）

本研究以豆豉为原料，采用响应面设计试验对超声波-热水浸提提取豆豉低聚糖的工艺进行了研究。在单因素试验结果基础上，选择超声时间、液料比、浸提温度、浸提时间进行4因素3水平的中心组合设计试验，再利用响应面分析试验进行工艺优化。研究结果表明，最佳提取条件为：超声时间28 m in，液料比24∶1（m L∶g），浸提温度为80℃，浸提时间为1.74 h，此提取条件下豆豉低聚糖的得率实测值为3.86%，预测值为3.91%，实测值与预测值相差甚小，说明模型具有一定的应用价值。

豆豉；低聚糖；超声波；响应面试验

豆豉是以大豆为主要原料，经过浸泡、蒸煮、摊凉、制曲、发酵等一系列工艺而制成的药食两用食物。目前对豆豉功能性的研究是一大热点，大多集中在豆豉中异黄酮和豆豉溶栓酶、纳豆激酶等有溶血栓作用的物质研究方面［1-2］，但对豆豉低聚糖的研究鲜有报道。豆豉中功能性低聚糖，既包括原料中天然存在的低聚糖［3］，如棉籽糖、蔗糖、水苏糖等，又有发酵过程中微生物产生的低聚糖，其产生主要有两大途径：一是通过微生物产生的糖苷转移酶的转糖基作用合成的；另一种是微生物产生的内切半纤维素酶类，如甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和木葡聚糖酶等水解半纤维素类多糖产生［4-5］。探讨豆豉低聚糖的提取与分离检测技术对于指导其进一步开发利用具有重要意义。

目前，关于低聚糖的提取方法报道较多，主要有传统的水浸提法［6-7］、碱提酸沉［8］、醇提法［9］、膜分离技术［10］、酶水解法［11-12］、微波法［13-15］和超声辅助技术［16-20］。其中，水浸提法虽然环保经济却不易达到理想的提取率；碱液浸取时间太长，大多在1.5 h左右；有机溶剂提取法存在溶剂耗量大、成本高等缺点；膜技术设备投资大、工艺较复杂；酶水解法存在工艺繁琐、酶成本高等缺点；而微波和超声波辅助提取技术应用到低聚糖的提取中，既提高了提取效率，又不破坏活性成分的结构和性能，是较为理想的新型提取方式。故本试验利用响应面法优化超声波辅助提取豆豉中的低聚糖，寻求其最佳工艺参数，旨在确定最适提取方法，以期为豆豉低聚糖的研究与应用提供一定的参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

豆豉：市售；石油醚、浓硫酸、苯酚、葡萄糖等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

XFB-200高速中药粉碎机：中国吉首忠诚制药机械厂；KQ2200DB超声波清洗器：昆山超声波有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂；722B型可见光分光光度计：天津市普瑞斯仪器有限公司；SHZD抽滤机：巩义市亭华有限责任公司；H-H-2水浴锅：金坛市医疗仪器厂；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；FA1004B分析天平：上海越平科学仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1豆豉低聚糖的提取工艺流程及操作要点

豆豉→烘干→粉碎过筛→石油醚回流脱脂→干燥→加蒸馏水→超声波处理→热水浸提提取→过滤→上清液浓缩→醇沉→离心→上清液浓缩、定容→冷冻干燥→豆豉低聚糖

操作要点：

粉碎：市售豆豉于60℃条件下烘干至质量恒定，用高速组织粉碎机粉碎，过40目筛。

脱脂：取一定量豆豉粉，置于索氏提取器中，加入30～60℃的石油醚溶液，在50℃下浸提6 h，低温干燥至质量恒定，即得到脱脂后的粉末备用。

浓缩醇沉：将提取液在减压旋转蒸发仪中50℃下浓缩至5 m L，加入30 m L体积分数95%乙醇至乙醇体积分数达85%进行醇沉过夜。

1.3.2豆豉低聚糖的提取工艺研究

按照1.3.1的提取工艺流程，固定超声功率400 W，分别考察超声时间、浸提温度、浸提时间和液料比4个单因素对豆豉低聚糖得率的影响，并在单因素的基础上选取该4个因素的3个较优水平进行响应面试验，确定超声波辅助热水浸提豆豉低聚糖的最优工艺条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1　响应面试验因素与水平Table 1 Facto rs and levels of response surface analysis

1.3.3豆豉低聚糖得率的测定

建立葡萄糖的标准曲线，并采用苯酚-硫酸法测定豆豉低聚糖的含量，低聚糖得率计算如下：

式中：x表示相当于葡萄糖的质量浓度，mg/m L；V1表示显色时的取样体积，mL；V2表示定容样品的体积，m L；V为提取液的定容体积，mL；m为样品质量，g。

2　结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线的建立

以葡萄糖质量浓度（x，mg/m L）为横坐标，低聚糖溶液在波长490 nm处的吸光度值（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，建立的葡萄糖标准曲线方程为y=7.786 8x+0.072 7，R2=0.996 4。结果表明，在一定范围内，二者线性关系良好。

2.2单因素试验

2.2.1超声时间优化单因素试验

固定超声功率400 W，在浸提温度为75℃，浸提时间为120 min，液料比15∶1（m L∶g）的条件下，超声时间分别在10 min、20 min、30 m in、40 min、50 min五个水平下进行提取后旋转浓缩，醇沉过夜，以豆豉、低聚糖得率为评价指标，考察超声时间与低聚糖得率的关系如图1所示。

图1　不同超声时间对豆豉低聚糖得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction rate of oligosaccharides

研究资料表示，超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，增大介质分子的运动速度和穿透力，可导致植物细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收电磁能产生大量的热量，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞和裂纹。孔洞和裂纹的存在使胞外溶剂容易进入细胞内，从而更有利于低聚糖的提取［12］。

从图1中可以看出，在超声波取时间10～30 min的范围内，随着超声时间的延长，豆豉低聚糖得率也随之逐渐提高，但是超过30 min后继续延长超声时间，得率不再提高反而降低。表明超声波处理时间太短，低聚糖溶出不充分；但处理时间过长，可能导致低聚糖结构发生变化，糖链发生断裂，最终使豆豉、低聚糖得率下降。故最佳的超声时间为30 min。

2.2.2浸提时间优化单因素试验

在固定超声时间为30 min，浸提温度为75℃，液料比15∶1（m L∶g）的条件下，浸提时间分别为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h五个水平进行测定，获得不同浸提时间对豆豉低聚糖得率的影响如图2所示。

从图2中可以看出，1～2 h之间得率随着浸提时间的延长而增加，在热水浸提时间为2 h左右时，得率达最大值。可能是由于时间过长，提取过程中不断产生热能，造成某些不稳定低聚糖的降解［19］。所以在低聚糖提取过程中，时间不宜过长，最佳浸提时间为2 h。

图2　不同浸提时间对豆豉低聚糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of oligosaccharides

2.2.3液料比优化单因素试验

固定超声时间为30 min，热水浸提时间为2 h，热水浸提温度为75℃，液料比分别在5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1（m L∶g）五个水平进行测定，不同料液比对豆豉低聚糖得率的影响如图3所示。

图3　不同液料比对豆豉低聚糖得率的影响Fig.3 Effect o f liquid-solid ratio on extrac tion rate of oligosaccharides

从图3中可以看出，随着液料比的增大，低聚糖的得率逐渐增大，当液料比＞20∶1（m L∶g）后，多糖得率增长渐趋平缓。说明随着溶解低聚糖的溶剂水体积的增大，更有利于低聚糖的溶出。但当样品中的低聚糖基本溶解出来之后，过多的溶剂不但不会增加低聚糖的得率，反而会增大提取成本，故最佳的液料比为20∶1（m L∶g）。

2.2.4浸提温度优化单因素试验

固定超声时间为30 min，浸提时间为2 h，液料比20∶1（m L∶g）的条件下，浸提温度分别为45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃、100℃七个水平进行测定，获得不同浸提温度对豆豉低聚糖得率的影响如图4所示。

从图4可以看出，随着浸提温度的升高，水分子运动越剧烈，加速了低聚糖的浸出，使得率增大，利于低聚糖的提取。但当浸提温度＞85℃时，得率下降原因可能是随着浸提温度的进一步升高，导致低聚糖的稳定性下降。故最佳浸提温度为85℃。

图4　不同浸提温度对豆豉低聚糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction tem pera ture on extrac tion rate of oligosaccharides

2.3响应面试验

2.3.1模型的拟合及方差分析

根据单因素试验结果，以超声时间、浸提时间、料液比、浸提温度4个影响因素为变量，豆豉低聚糖得率为响应值（Y），采用4因素3水平试验对豆豉低聚糖的提取进行优化，试验结果见表2，方差分析见表3。

表2　Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Experim ental design and results of response surface analysis

利用Design-Expert 8.0.4对试验数据进行分析，得到二次回归方程：Y=3.43-0.088A+0.068B-0.040C-0.019D+ 0.065AB-0.078AC-0.030AD-0.13BC-0.11BD-0.12CD+ 0.030A2-0.57B2-0.68C2-0.63D2。

表3　响应面试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of the fitted regression equation

对上述回归模型进行方差分析和显著性检验结果见表3。从表3可以看出，模型的F=50.97，P＜0.000 1，表明该二次方程模型具有高度的显著性；失拟项P=0.173 4＞0.1，表明模型的失拟项不显著；方程相关系数R2=0.980 8，说明98.08%的数据可以用此模型解释。另外，该模型的变异系数为3.61，＜10，说明该方程稳定性较好。信噪比为21.510，＞4，说明该模型分辨力很高，能正确地反映试验结果。由以上分析可知，该方程对试验拟合较好，能够用上述模型较好地预测各指标实际值。

此外，由A、B、C、D 4个因素的F值判断，4种因素对低聚糖得率的影响大小依次为A＞B＞C＞D，即超声时间＞浸提时间＞料液比＞浸提温度。其中超声时间（A）对低聚糖得率的影响达到极显著水平（P＜0.01），浸提时间（B）达显著水平（P＜0.10）。浸提时间、液料比和浸提温度的曲面效应（B2、C2、D2）对结果有极显著影响（P＜0.01）；BC、BD、CD项交互效应显著（P＜0.10），即浸提时间、浸提温度和料液比之间的交互作用对豆豉低聚糖的得率有显著影响，其交互作用的响应面图和等高线图如图5所示。

图5　浸提时间、料液比和浸提温度对豆豉低聚糖得率影响的响应曲面和等高线Fig．5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction time，liquid-solid ratio and extraction tem pera ture on extrac tion rate of Douchi o ligosaccharides

2.3.2试验结果及验证试验

对回归方程取一阶偏导，得到三元一次方程组，求解得出超声波提取的最佳工艺为：超声时间28.14min，液料比24.35∶1（m L∶g），浸提温度为80.34℃，浸提时间为1.74 h。在此条件下，豆豉低聚糖的得率预测为3.91%。考虑到实际操作便利性，将此条件修正为：超声时间28 min，液料比24∶1（m L∶g），浸提温度为80℃，浸提时间为1.74 h。在上述修正条件下进行验证试验，所得豆鼓、低聚糖得率为3.86%，这与模型预测值接近，说明此模型作为超声波提取的数学模型是可行的。

3　结论

本研究采取Box-Benhnken中心组合试验设计并结合响应面分析法优化了豆豉低聚糖的超声辅助提取工艺，建立了超声时间、浸提时间、浸提温度和液料比4个因素的超声辅助提取豆豉低聚糖的二次多项式数学模型。最终确定的最佳工艺参数为：超声时间28 min，液料比24∶1（m L∶g），浸提温度80℃，浸提时间1.74 h，此条件下豆豉低聚糖得率达3.86%。

本实验利用超声波独特的机械振动作用和空化作用来破坏豆豉的细胞壁，使水能快速渗透到豆豉细胞中，促使低聚糖溶解并扩散到溶液中，从而提高了低聚糖的得率。该提取液中的水溶性多糖经体积分数85%乙醇醇沉后得到有效的分离，而还原糖的含量极少（0.04%），可以忽略不计，故本试验以总糖得率作为低聚糖得率是准确可行的。目前，关于豆豉低聚糖具体组分的研究报道甚少，尚不明确，豆豉低聚糖的分离纯化条件、成分测定及其应用有待进一步研究。

［1］蒋立文.发酵豆豉的研究进展［J］.食品安全质量检测学报，2013，4（6）：1803-1809.

［2］牛广财，贾亭亭，魏文毅，等.淡豆豉的研究进展［J］.中国酿造，2013，32（9）：6-10.

［3］张雪梅，张玲，高飞虎，等.豆豉的营养研究现状及发展前景［J］.南方农业，2015，8（4）：51-53.

［4］熊骏，李海燕，柳陈坚.传统大豆发酵食品中大豆低聚糖的生理功能研究［J］.中国微生物态学杂志，2010，22（1）：77-80.

［5］杜木英，陈宗道，阚建全，等.豆豉保健功能成分研究进展［J］.粮食与油脂，2003（2）：9-11.

［6］王照波，周文美，徐子婷，等.雪莲果水溶性低聚糖的提取工艺［J］.贵州农业科学，2010，38（2）：173-176.

［7］王娟，程燕峰，苏锦明，等.香蕉低聚糖的分离纯化及理化性质研究［J］.食品与发酵工业，2008，34（12）：176-179.

［8］白英.肉纵容低聚糖提取工艺的研究［J］.食品工业科技，2006，27（10）：118-119.

［9］周丽，唐忠厚，杨向东，等.山药低聚糖的微波提取及含量测定［J］.中国酿造，2012，31（8）：44-46.

［10］苏浩，余以刚，杨海燕，等.膜分离技术在水溶性大豆多糖提取中的应用［J］.食品工业科技，2009，30（8）：216-217.

［11］王萍，葛丽花，夏德安.酶解麦麸制备阿魏酸低聚糖的研究［J］.中国粮油学报，2008，23（1）：152-156.

［12］曽凤彩，王文侠，宋春丽.酶解玉米麸皮制备阿魏酰低聚糖的研究［J］.粮食与饲料工业，2012，12（2）：31-36.

［13］王章存，刘卫东，王绍峰.微波法提取大豆低聚糖的研究［J］.中国农学报，2006，22（6）：102-104.

［14］刘立洋，金龙国，刘章雄，等.微波和超声两种技术提取大豆低聚糖的效果［J］.大豆科学，2008，27（5）：838-843.

［15］刘峥，蒋毅民.微波法提取大豆中低聚糖的研究［J］.食品研究与开发，2002，23（2）：24-26.

［16］田玉庭，卢旭，郑宝东.响应面法优化莲子低聚糖超声波辅助提取工艺［J］.北京工商大学学报：自然科学版，2012，30（2）：17-20.

［17］刘露，张雁，张名位，等.响应面法优化超声波辅助提取山药低聚糖的工艺研究［J］.广东农业科学，2014，41（11）：100-104.

［18］赵迎春，卢家炯.超声波辅助提取雪莲果中低聚果糖及其纯化的初步研究［J］.广西轻工业，2010，26（1）：3-5.

［19］唐雪娟，王森，王娟.超声波与温水法提取香蕉低聚糖的比较［J］.农业工程学报，2013，40（22）：111-114.

［20］周泉城，申德超，区颖刚，等.超声波辅助提取经膨化大豆粕中低聚糖工艺［J］.农业工程学报，2008，24（5）：245-249.

Optim ization of ultrasonic-assisted extraction of Douchi oligosaccharides by response surface methodology

JI Yiping，CHEN Xin，SHEN Ruim in
（College of Food and Biology Science and Technology，Wuhan Institute of Design and Sciences，Wuhan 430205，China）

Using Douchi as raw material，the oligosaccharides extraction technology of ultrasonic-hot water were studied w ith response surface methodology.On the basis of single factor experiment results，four factors and three levels central composite design was conducted w ith ultrasonic time，liquid to material ratio，extraction time and temperature as experimental factors，and then response surface methodology was used to optimize the extraction condition.Results showed that the optimum extraction technology was as follows：ultrasonic time 28 m in，extraction temperature 80℃，time 1.74 h，liquid to material ratio 24∶1（m l∶g）.The yield of oligosaccharides under these conditions could reach up to 3.86%，while the predicted value was 3.91%.The difference of the measured value and predicted values were very small，which indicated that the model had certain application value.

Douchi；oligosaccharides；ultrasonic wave；response surface methodology

TS201．1

0254-5071（2016）05-0129-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．027

2016-01-12

武汉设计工程学院校科研项目（201302）

吉义平（1984-），女，讲师，硕士，研究方向为食品功能性成分的提取纯化、检测及其应用。