EZH2在急性髓系白血病病程中的表达和对预后判断的意义研究

孙健　王晓波　张旗　慕俐君

EZH2在急性髓系白血病病程中的表达和对预后判断的意义研究

孙健王晓波张旗慕俐君

目的：探讨DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT1）与EZH2在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中的表达及其相关性。方法：采用荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）检测大连医科大学附属第二医院2014年1月至2015年1月50例初治AML患者骨髓细胞中DNMT1与EZH2 mRNA的表达水平，分析DNMT1表达水平与临床特征和预后的关系以及与EZH2的相关性。结果：50例AML患者骨髓细胞中DNMT1 mRNA的表达显著高于30例正常供者（2.72±0.73 vs.0.89± 0.27，P＜0.01）；EZH2的表达水平也显著高于正常供者（4.39±1.06 vs.1.87±0.33，P＜0.01）；EZH2与DNMT1的表达水平呈显著正相关（r=0.51，P=0.002）；DNMT1表达水平与外周血幼稚细胞比例≥60%（P＜0.05）、WBC≥50×109/L（P＜0.05）呈显著相关；DNMT1高表达组患者中位生存时间15个月（95%CI为9～19个月），显著低于DNMT1低表达组患者的32个月（95%CI为27～40个月，P= 0.006）。结论：DNMT1和EZH2在AML患者中均高表达，两者表达水平呈正相关，DNMT1与AML患者预后不良相关。

DNMT1EZH2 急性髓系白血病相关性

表观遗传学变异在白血病的发生、发展和转移中发挥重要作用。组蛋白甲基转移酶EZH2是特异性H3K27甲基转移酶，通过与DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT1）合作，致使靶基因CpG岛区DNA甲基化导致靶基因的永久性沉默，从而参与异染色质的形成及基因转录调控［1］。有研究表明，EZH2在多种恶性实体肿瘤组织中表达异常增高，并且具有癌基因的活性［2］。EZH2在高危骨髓增生异常综合征患者及急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者中的表达水平显著高于低危骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者及正常人群［3-4］，提示EZH2在髓系恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用。但是，DNMT1的表达在AML中有何临床意义？EZH2在AML中的表达与DNMT1有无相关性？目前国内相关报道尚少。本研究就DNMT1和EZH2在AML中的表达及其相关性，以及与AML临床特征、预后的关系作初步探讨，为急性白血病的治疗提供新的思路。

1　材料与方法

1.1病例资料

回顾性分析2014年1月至2015年1月大连医科大学附属第二医院50例初治AML患者，所有患者均经骨髓形态细胞学检查、免疫组织化学染色或流式细胞术免疫分型确诊。按照FAB白血病诊断分型标准，其中M1 8例、M2 13例、M4 12例、M5 17例。男性33例，女性17例；中位年龄42.5（12～62）岁；中位WBC为38.9（1.9～359.7）×109/L；外周血原幼稚细胞比例中位数为61（5～87）%；骨髓幼稚细胞比例＜60%为22例，骨髓幼稚细胞比例≥60%为28例；按SWOG标准将50例患者根据染色体核型分析结果分为3组，良好14例、中危30例、高危6例。对照组为30例正常供者。所有标本的采集均经过被研究对象或其家属知情同意及医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1骨髓单个核细胞分离常规骨髓穿刺，抽取患者骨髓液3～5 mL，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液分离出骨髓单个核细胞，PBS洗涤2遍后加1 mL Trizol反复吹打至无沉淀，-80℃保存备用。

1.2.2总RNA提取按Trizol说明书进行操作抽提总RNA。DEPC水溶解后采用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，A260/A280＞1.8方可用于后续逆转录。

1.2.3逆转录反应按照TAKARA公司的Prime-Script逆转录试剂盒说明书进行。将1 μg总RNA，1 μL Oligo（dT）18，1 μL dNTPmix充分混匀后，置65℃作用5 min后迅速冰上冷却，再加入4 μL 5×PrimeScript缓冲液，1 μL Ribonuclease Inhibitor，最后加入1 μL Enzyme Mix逆转录酶（200 U/μL）至终体积为20 μL，42℃作用1 h，70℃作用10 min后冰上冷却，获得的cDNA第1链立即行PCR或-80℃冰箱保存待用。

1.2.4荧光定量PCR应用SYBR Green荧光定量PCR （fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）试剂盒进行检测。EZH2上游引物为5'-GACCCTGACCTCTGTCTT ACTT-3'，下游引物为5'-GATGGTGCCAGGCAATAGA TG-3'。DNMT1上游引物为5'-AACCTTCACCT AGCCCCAG-3'，下游引物为5'-CTCATCCGATTTGGCT CTTCA-3'。内参GAPDH上游引物为5'-TGAAGGTC GGAGTCAACGG-3'，下游引物为5'-CTGGAAGATGGT GATGGGATT-3'。PCR扩增条件：95℃30 s，95℃5 s，60℃40 s，40个循环。所有反应设置3个复孔。采用相对定量法，以2-ΔCt表示标本中目的基因的相对表达量，其中ΔCt=（CtEZH2/CtDNMT1-Ctβ-actin）。

1.3统计学分析

2　结果

2.1DNMT1在AML患者中的表达

FQ-PCR结果显示，50例AML患者骨髓细胞中DNMT1 mRNA的表达值为2.72±0.73，显著高于30例正常供者0.89±0.27（P＜0.01）；DNMT1在AML患者中的表达阳性率为85.9%，显著高于正常供者中的表达阳性率32.6%（P＜0.01）。

2.2EZH2在AML中的表达及其与DNMT1的相关性

EZH2在50例AML患者骨髓细胞中的表达水平为4.39±1.06，显著高于30例正常供者的1.87±0.33 （P＜0.01）；EZH2在AML患者中的表达阳性率为87.3%，显著高于正常供者中的表达阳性率29.5%（P＜0.01）。相关性分析显示，EZH2 mRNA在AML患者骨髓细胞中的表达水平与DNMT1 mRNA的表达水平均呈显著正相关，相关系数（r=0.51，P=0.002，图1）。

图1　DNMT1表达水平与EZH2表达水平呈正相关Figure 1　Positive correlation between DNMT1 and EZH2 expression levels

2.3DNMT1表达水平与临床特征之间的关系

AML患者骨髓细胞中DNMT1 mRNA表达水平与外周血幼稚细胞比例≥60%（P＜0.05）、WBC≥50× 109/L（P＜0.05）显著相关，而与性别、年龄、骨髓中幼稚细胞比例、LDH水平以及染色体核型相关预后均不相关（表1）。

2.4DNMT1和EZH2的表达水平与AML的病程相关性

治疗前及复发AML患者骨髓细胞中DNMT1和EZH2 mRNA表达水平显著高于正常供者；治疗后缓解的AML患者骨髓细胞中DNMT1和EZH2 mRNA表达水平与治疗前相比显著降低（P＜0.05，表2）。

2.5DNMT1和EZH2表达水平与AML患者预后的关系

所有病例中位随访时间为16（3～43）个月，38%（19/50）患者死亡。以DNMT1 mRNA表达水平中位值2-ΔCt=2.16作为截断值，将DNMT1在AML中的表达分为高表达组和低表达组。应用Kaplan-Meier法生存分析表明，DNMT1高表达组患者中位生存时间15个月（95%CI为9～19个月），显著低于DNMT1低表达组患者的32个月（95%CI为27～40个月），差异具有统计学意义（P=0.006）。EZH2高表达组患者中位生存时间17个月（95%CI为11～21个月），显著低于EZH2低表达组患者的36个月（95%CI为26～42个月），差异具有统计学意义（P=0.003，图2）。

表1　DNMT1表达水平与AML患者临床特征之间的关系Table 1　Relationship of the expression level of DNMT1 with the clinical characteristics of patients with AML

表2　DNMT1和EZH2的表达水平与AML的病程相关性Table 2　Correlation of DNMT1 and EZH2 expression levels with AML course

图2　DNMT1和EZH2表达水平与AML患者预后的关系Figure 2　Relationship of the expression levels of DNMT1 and EZH2 with the prognosis of patients with AML

3　讨论

AML是发生于造血干/祖细胞的恶性增殖性疾病。表观遗传学变异在白血病的发生、发展和转移中发挥重要作用［5-6］。近几年来，染色体甲基化异常逐渐成为AML研究的热点，AML中存在一组基因的高度甲基化，导致这些基因表达的沉默或抑制，从而促进正常造血干细胞向白血病细胞的转化［7-8］。EZH2基因是果蝇ZESTE基因增强子的人类同源物，其编码蛋白含有高度保守的SET结构域，可甲基化组蛋白H3K27，通过调节染色体组蛋白的甲基化状态而沉默分化基因［9-10］。

EZH2导致靶基因高度失活的机制为：1）通过与DNMT1合作，致使靶基因CpG岛区DNA甲基化导致靶基因的永久性沉默；另一种是先通过PRC2催化H3K27me3，甲基化的H3K27再作为锚定点结合HPC，再招募PRC1的其他蛋白结合至靶基因的polycomb反应元件来共同完成的［2］。DNMT1是介导DNA甲基化的主要元件，其对沉默靶基因的甲基化作用中受到EZH2作为上游因子的调控作用［11-13］。本研究前期研究表明EZH2在AML中高表达，且与临床高白细胞和血清LDH水平升高显著相关，同时EZH2高表达患者预后较低表达患者差［4］。然而DNMT1在AML中的表达及其与EZH2的表达有无相关性目前尚不清楚。

本研究应用FQ-PCR法检测50例AML患者DNMT1的表达情况，发现DNMT1在AML患者的骨髓细胞中显著高表达，而且其表达水平与其上游调控基因EZH2呈正相关。Purkait等［14］研究发现成胶质细胞瘤患者DNMT1与EZH2 mRNA具有强的阳性相关性，DNMT1与EZH2低表达患者的生存期明显高于DNMT1与EZH2高表达患者。Ning等［15］研究发现DNMT1与EZH2的甲基化通过抑制miRNA-200b/a/429，从而促进肿瘤的发生发展，EZH2在DNMT1招募启动子序列的过程中起到必要作用。上述研究结果提示DNMT1与EZH2相互作用，调控抑癌基因的启动子甲基化，导致其转录失活，从而导致白血病恶性克隆的形成。然而DNMT1如何与EZH2相互作用，其机制还有待深入研究。

本研究还发现DNMT1 mRNA表达水平与外周血幼稚细胞比例、WBC计数呈显著正相关，提示DNMT1能够促使白血病细胞从骨髓释放到外周血，迁移至髓外形成浸润病灶。而且DNMT1高表达的患者预后较低表达患者差，表明DNMT1可能是AML患者预后的判断指标。

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（2016-05-03收稿）

（2016-07-05修回）

孙健专业方向为骨髓衰竭疾病及造血干细胞移植。

E-mail：sunjian_1973@aliyun.com

Research progress and prognostic significance of EZH2 in acute myeloid leukemia

Jian SUN，Xiaobo WANG，Qi ZHANG，Lijun MU

Correspondence to:Lijun MU；E-mail:jxw10144613@126.com

Department of Hematology，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China

Objective:To investigate the relationship between DNA methyltransferase（DNMT1）and EZH2 gene expression levels and their clinical significance in patients with acute myeloid leukemia（AML）.Methods:The mRNA expression levels of DNMT1 and EZH2 in 50 AML cases and 30 healthy controls were quantified through real-time PCR.The relationship among DNA methyltransferase（DNMT1）and EZH2，clinicopathological factors，and prognosis was analyzed.Results:The mRNA expression of DNMT1 in the AML cases（2.72± 0.73）was significantly higher than that in the healthy controls（0.89±0.27）（P＜0.01）.The mRNA expression of EZH2 in the AML cases （4.39±1.06）was also significantly higher than that in the healthy controls（1.87±0.33）（P＜0.01）.The expression of DNMT1 was positively associated with that of EZH2（r=0.51，P=0.002）.The expression of DNMT1 was also associated with PB%and WBC≥50×109/L（P＜0.05）.The overall survival of the group with a high-mRNA-expressing DNMT1 was 15 months（95%CI=9-19 months）.This period was significantly shorter than that of the group with low-mRNA-expressing DNMT1（32 months，95%CI=27-40 months；P=0.006）.Conclusion:DNMT1 and EZH2 expression levels were downregulated.These levels were associated with poor AML prognosis.The expression of DNMT1 was also positively associated with that of EZH2.

DNMT1，EZH2，AML，correlation

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.16.518

大连医科大学附属第二医院血液内科（辽宁省大连市116027）

慕俐君jxw10144613@126.com