大孔树脂纯化东北山核桃壳棕色色素工艺的研究

秦微微，金婷，王爽，宋学东，丁振铎，张衡（.黑龙江生态工程职业学院，黑龙江哈尔滨5005；.枣庄学院生命科学系，山东枣庄7760；.哈尔滨市农业信息中心，黑龙江哈尔滨500）

大孔树脂纯化东北山核桃壳棕色色素工艺的研究

秦微微1，金婷2，王爽1，宋学东1，丁振铎1，张衡3
（1.黑龙江生态工程职业学院，黑龙江哈尔滨150025；2.枣庄学院生命科学系，山东枣庄277160；3.哈尔滨市农业信息中心，黑龙江哈尔滨150021）

为减少东北山核桃壳棕色色素的杂质，提高其色价，选择4种大孔吸附树脂，分别测定了它们对棕色素的吸附率和解吸率，筛选出较优的棕色素吸附剂，并对其吸附性能进行了考察。结果表明：NKA-9树脂对棕色素有较好的吸附和解吸效果，当浓度为0.1mg/mL时树脂的吸附效果最好，上样液的最佳pH值为3.0，最佳解析液为70%乙醇溶液，最佳上样液流速为2.0mL/min，最佳洗脱液流速为1.0mL/min，洗脱剂用量不少于3BV。经树脂纯化后，色素色价可提高至162.81%。

大孔树脂；纯化；核桃壳；棕色素

核桃壳属于山核桃加工的废弃物，在黑龙江省林地面积可达1 962.13万公顷，山核桃的产量非常丰富。随着核桃产品加工量的逐年扩大，核桃壳的利用引起了人们的关注。对核桃壳的深入研究发现，核桃壳中含有天然的棕色色素，将这种天然色素提取出来，并用于食品加工中，既避免了核桃壳资源的浪费，又满足了人们对健康、安全的天然色素的需求，充分地体现了核桃壳的价值［1-2］。核桃壳棕色色素在提取过程中，其粗提液中含有糖类、蛋白质等杂质，为了提高棕色素的品质，拓宽其应用范围，本文对粗提液进行了纯化研究。

大孔吸附树脂具有理化性质稳定，不溶于酸碱和有机溶剂，选择性好，不受无机盐的影响，解吸温和、再生简便、使用周期长等优点。自20世纪70年代以来，大孔树脂分离技术被广泛用于天然产物分离［3-5］。目前，利用大孔树脂纯化东北山核桃壳的报道很少，本文就大孔树脂纯化山核桃壳棕色色素的工艺进行了研究，旨在为东北山核桃壳棕色色素的深入研究奠定一定的理论参考。

1　材料与仪器

1.1材料

东北山核桃壳采自黑龙江省尚志市山区。

1.2仪器

T6-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用；SHY-2A双功能数显水浴恒温振荡器：江苏金城；JY20002精密电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；R-501旋转蒸发仪：上海申顺；PHS-3C酸度计：上海雷磁；DZF-6050真空干燥箱，上海博讯；DOB-20003型光电分析天平：重庆实验设备厂。

1.3试剂

HCl、NaOH、95%乙醇均为国产分析纯；大孔树脂（各项参数详见表1）：天津光复精细化工研究所。

表1　大孔树脂的参数Table 1　Parmeters of different macroporous adsorptive resins

2　方法

2.1山核桃壳棕色色素的制备

取5.0g粉碎至40目～80目的山核桃壳粉，加入50%的乙醇溶液100 mL，在80℃水浴中浸提1 h，冷至室温后过滤，滤渣同法再浸提一次，合并两次滤液，减压浓缩，真空干燥得棕色粉末。

2.2棕色色素吸收光谱的确定

取50 μg/mL核桃壳棕色素溶液（以50%乙醇作溶剂），用T6-1901紫外可见分光光度计在200nm～800 nm波长范围内进行光谱扫描，确定最大吸收波长。

2.3树脂的预处理

将新购置的大孔树脂置于干净的烧杯中，加入体积分数为95%的乙醇浸泡24 h，倾去上层悬浮物，继续用95%的乙醇反复洗涤，至流出液与蒸馏水按照体积比为1∶5混合无白色混浊为止，然后用蒸馏水洗至无醇味备用。

2.4大孔树脂纯化山核桃壳棕色色素工艺的研究

2.4.1树脂筛选

准确称取已处理的NKA-9、D101、AB-8、D4020大孔树脂各5.0 g，分别置于150 mL三角瓶中，各加入20.0 mL一定浓度的色素溶液，用保鲜膜封口，于25℃恒温振荡器上140 r/min振荡吸附3 h后，测定色素溶液的吸光值。用蒸馏水洗去树脂上残余色素后吸干水分。然后将树脂再次置于150 mL三角瓶中，分别加入20.0 mL 60%的乙醇溶液洗脱树脂，用保鲜膜封口，于25℃恒温振荡器上140 r/min振荡解吸3 h后，测定色素溶液的吸光值。按照（1）、（2）式，计算各树脂的吸附率及解吸率。

式中：D1为吸附率，%；A0为吸附前样品吸光值；A1为吸附后样品吸光值。

式中：D2为解吸率，%；A0为吸附前样品吸光值；A1为吸附后样品吸光值；A2为解吸液吸光值。

2.4.2树脂静态吸附与解析的研究

2.4.2.1上样液浓度对树脂吸附的影响

称取5.0 g已处理的NKA-9树脂6份，分别置于6个150 mL三角瓶中，分别加入浓度0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175 mg/mL的粗提取液各20.0 mL，用保鲜膜封口，在恒温振荡器上于25℃、140 r/min条件下吸附3 h，测定吸附后色素液的吸光值，计算吸附率。

2.4.2.2pH对树脂吸附率的影响

配制pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的0.1 mg/mL的色素溶液各20.0 mL，测定吸光值后分别置于150 mL三角瓶中。分别称取已处理的NKA-9树脂5.0 g于5个三角瓶中，用保鲜膜封口，置恒温振荡器上于25℃、140 r/min振荡3 h，充分吸附后测定色素液的吸光值，计算吸附率。

2.4.2.3洗脱剂浓度对解吸的影响

精确称取5份经预处理过的NKA-9树脂5.0 g于150 mL的三角瓶中，分别加入0.1 mg/mL的色素溶液各20.0 mL，用保鲜膜封口，置恒温振荡器上于25℃、140 r/min振荡3 h，过滤，过滤后的树脂再分别加入体积分数为50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液20 mL，于25℃、140 r/min条件下振荡解吸3 h，测定解析液的吸光值，计算解析率。

2.4.3树脂动态吸附与解析的研究

2.4.3.1上样流速对树脂吸附率的影响称取30.0 g预处理后的NKA-9大孔树脂，采用湿法装柱（11 cm×Φ3 cm），在同样条件下分别以1.0、2.0、3.0 mL/min的流速收集流出液，测定流出液的吸光值，确定上样流速对树脂吸附的影响。

2.4.3.2洗脱流速及洗脱剂用量对树脂解析色素的影响

将吸附饱和的树脂在同样条件下，先用2BV（100mL）蒸馏水冲洗柱子，以适量的70%乙醇作为洗脱剂，在1.0、2.0、3.0 mL/min的速度下洗脱，测定流出液的吸光值，确定洗脱流速对树脂解析的影响。

2.5色素的色价与纯化率

将山核桃壳棕色色素的粗提液和纯化液分别进行，浓缩，干燥，得固体粉末。分别精确称量0.100 0 g，用50%乙醇将其溶解定容至100 mL，再取1 mL溶液定容至100 mL，在289 nm下测定其吸光值。按照公式（3）、（4）计算色价和纯化率。

式中：E为色价；A为吸光值；m为样品质量，g；f为稀释倍数，E纯化后为纯化后色价；E纯化前为纯化前色价。

3　结果分析

3.1棕色色素吸收光谱

棕色色素吸收光谱如图1。从吸光曲线上可以看出，核桃壳棕色素在289 nm处出现最大吸收峰，即λmax=289。

图1 棕色素的吸收光谱Fig.1　UV absorption spectrum of the brown pigment

3.2树脂的筛选

4种树脂对棕色素的吸附率和解析率见表2。表中显示，树脂NKA-9的吸附率最高，达到70%以上，树脂AB-8和D4020的吸附率在60%上下，D-101的吸附率最低；4种树脂的解析率以D101最高达到95%以上，NKA-9稍次之，AB-8最低。

大孔树脂的吸附率与其比表面积、表面极性、孔结构等有关，尤其是比表面积在吸附过程中起较大作用［6］。4种树脂中，NKA-9的吸附率最高，比表面积也是最小的，在解析率的比较中，NKA-9的解析率仅次于D-101，但D-101的吸附率较之NKA-9相差甚多，所以，综合考虑，树脂NKA-9为纯化色素的较好树脂。

表2　4种树脂对棕色素的吸附率和解析率的影响Table 2 Absorption and desorption of different resins to the brown pigment

3.3树脂静态吸附与解析的研究

3.3.1上样液浓度对树脂吸附的影响

上样液浓度对树脂吸附的影响如表3。

表3　不同上样液浓度对树脂吸附率的影响Table 3 Effect of different sample concentration of adsorption to absorption

由表3可知，解析率随着上样液浓度的增加而上升，当浓度为0.1 mg/mL时，吸附率达90.0%，之后随着样液浓度的增加，吸附率变化很小。因此，选取0.1 mg/mL为上样液浓度。

3.3.2pH值对树脂吸附率的影响

pH值对树脂吸附率的影响见图2。

图2pH值对树脂吸附率的影响Fig.2　Adsorption of resin NKA-9 to the brown pigment at different pH values

溶液pH值改变可以改变溶液的极性，影响有效成分和大孔树脂间的分子间作用力。从pH由2.0到6.0的递增过程中，树脂对色素的吸附率呈先升后降的趋势，当pH为3.0时色素的吸附率最高，达到92.1%。因此，选择3.0为最佳吸附溶液pH值。

3.3.3洗脱剂浓度对解吸的影响

洗脱剂浓度对解吸的影响见图3。

图3　棕色素在不同乙醇浓度下的解析率Fig.3　Desorption of the brown pigment under different concentrations of ethanol

由图3可以看出，解析溶剂乙醇浓度越高，色素的解析率越高。乙醇是一种极性溶剂，浓度越高，对吸附剂与色素之间的作用力改变越大，进而增加了树脂中被吸附色素的溶出，从而树脂的解析率就会增大。当乙醇体积浓度达到70%后，色素解析附率增幅平缓，变化不明显。因此，选择70%乙醇作为洗脱剂。

3.4树脂动态吸附与解析的研究

3.4.1上样液流速对吸附的影响

上样液流速对吸附的影响如图4所示。当流出液的吸光值为上柱前色素液吸光值的1/10时，可确定为泄露点，根据其持续的时间来选择合理的动态吸附流速［7］；流速为1.0 mL/min时，流出液大约达到300 mL出现泄露点，当流速为2.0 mL/min时，流出液大约达到275mL出现泄露点，两者相差不明显，但从时间上考虑，2.0 mL/min的流速会快一些。但当流速为3.0 mL/min时，流出液大约达到175 mL出现泄露点，与前两者比较，泄漏点出现明显偏早，即总的吸附量会少。因此，从泄漏点出现的早晚及时间上综合考虑，选择2.0 mL/min为最佳吸附流速。

图4　吸附流速对纯化效果的影响Fig.4　Effect of adsorption rate on the purification effect

3.4.2洗脱流速及用量对树脂解析色素的影响

洗脱流速及用量对树脂解析色素的影响如图5所示，当洗脱剂流速不同时，洗脱曲线也有所不同，当流速为1.0 mL/min时洗脱效果最好，洗脱剂用量最少；当洗脱流速变快时，洗脱峰出现滞后，洗脱剂用量增多，因此，选择洗脱流速为1.0 mL/min为最佳洗脱流速，洗脱剂用量应不少于3 BV。

图5　洗脱流速对纯化效果的影响Fig.5　Effect of desorption rate on the purification effect

3.5色素的色价与纯化率

粗提色素和纯化色素的色价及纯化率如表4。从表中可以看出，经大孔树脂NKA-9纯化后，树脂纯度增幅较大，纯化率达到162.81%，因此经大孔树脂纯化可有效提高色素的纯度。

表4　色素色价及纯化率Table 4　Color value and purification rate of the brown pigment

4　结论

本研究确定的核桃壳棕色色素的纯化条件为：NKA-9型大孔树脂，上样液浓度为0.1 mg/mL，上样液pH值为3.0，解析液乙醇浓度为70%，上样液流速为2.0 mL/min，洗脱液流速为1.0 mL/min，洗脱剂用量不少于3 BV。经纯化后，色素色价提高较明显，纯化率可达162.81%。

［1］秦微微，张凌.国内核桃壳综合利用技术的研究现状［J］.食品工业，2012，33（11）：146-148

［2］李维莉，马银海，刘增康，等.核桃壳棕色素的提取及性质研究［J］.食品科学，2008，29（12）：339-341

［3］赵丽萍，江岩.AB-8、NKA两种大孔树脂对药桑椹花青素分离纯化的比较［J］.食品科技，2013，38（4）：219-223

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［7］舒国伟，陈世伟，李世玉，等.XDA-7大孔树脂分离纯化黄姜色素的研究［J］.中国调味品，2014，39（2）：84-87

Study on Purification Process of Resin to Northeast Walnut Shell

QIN Wei-wei1，JIN Ting2，WANG Shuang1，SONG Xue-dong1，DING Zhen-duo1，ZHANG Heng3
（1.Heilongjiang Vocational Institute of Ecological Engineering，Harbin 150025，Heilongjiang，China；2.Life Science Department of Zaozhuang University，Zaozhuang 277160，Shandong，China；3.Agricultural Information Center of Harbin City，Harbin 150021，Heilongjiang，China）

In order to reduce the impurities of brown pigments from northeast walnut shell and improve its color value，type of macroporous resin for purification of pigments was studied and the purification process conditions was researched.The characteristics of adsorption rates and desorption rates of four kinds of macroporous resins （D-101，D-4020，AB-8，NKA-9）to the brown pigment are investigated.The results showed that NKA-9 resin was the suitable resin for purifying the brown pigment.From the above investigations and analysis，the optimized conditions were obtained as 0.1 mg/mL sample concentration of adsorption，pH value 3.0，70%alcohol of the suitable elution agent，the optimized flow rates of adsorption were 2.0 mL/min，the optimized flow rates of desorption were 1.0 mL/min，the consumption of elution agent weren′t less than 3 BV.After purification，purification rate of color value was ahieved 162.81%.

macroporous resin；purification；walnut shell；brown pigment

2015-09-01

黑龙江省森林工业总局2011年科技计划项目（sgzjY2011001）

秦微微（1980—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：食品检测。