秘鲁巨鱿软骨硫酸软骨素理化性质研究

李燕妮，郭琳，许维娜（滨州医学院葡萄酒学院，山东烟台264003）

秘鲁巨鱿软骨硫酸软骨素理化性质研究

李燕妮，郭琳，许维娜
（滨州医学院葡萄酒学院，山东烟台264003）

探索一种新的硫酸软骨素来源。以秘鲁巨鱿软骨为原料，经过酶解、超滤浓缩和乙醇沉淀的方法获得硫酸软骨素。秘鲁巨鱿硫酸软骨素得率为3.2%，比旋度为-25.2°，黏均分子量为157 000，硫酸软骨素E型二糖占总二糖比例的17%。秘鲁巨鱿软骨可以作为一种硫酸软骨素新原料。

秘鲁巨鱿；硫酸软骨素；酶解高效液相；E型硫酸软骨素二糖

硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是一种结构复杂的糖胺聚糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺（GlcA-GalNAc）以β-1，3糖苷键连接形成二糖，二糖单位之间以β-1，4糖苷键连接而形成多聚糖［1-2］。硫酸软骨素广泛存在于各种动物组织中，尤其在软骨和结缔组织中含量丰富，不同生物或者同一生物的不同组织所含CS的种类均不同［3］。

根据CS的结构特点，通常将天然来源的CS硫酸化二糖分为A、B、C、D、E、F、H、K、L和M等［4-5］。其中鱿鱼硫酸软骨素中特有的CS-E型二糖可用于抗抗疟疾、抑制I型单纯疱疹病毒（HSV-I）的感染和神经系统修复，作为新的食品原料日渐受到重视［6-8］。

秘鲁巨鱿是美洲大赤鱿的俗称，属真鱿科（ommastrephida）美洲大赤鱿属（Dosidicus），其生命周期短，生长迅速，是迄今为止发现的个体最大，资源最丰富的鱿鱼物种之一［9］。本文以其头部软骨为原料进行试验，使用木瓜蛋白酶处理软骨，结合超滤方法来提取和纯化硫酸软骨素，并对其理化性质和结构进行分析，旨在为其在功能性食品、生物医药及其它相关领域的应用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

秘鲁巨鱿软骨：烟台大宸食品有限公司；木瓜蛋白酶：广西南宁庞博生物工程有限公司；硫酸软骨素标准品：中国药品生物制品检定所；鲨鱼硫酸软骨素标准品：西格玛；无水乙醇等其它检验试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

Primo R高速冷冻离心机：德国Heraeus公司；Minimate TFF system超滤机：PALL；8453型紫外－可见光分光光度计：惠普上海仪器有限公司；Nexus 5DXC FT—IR红外光谱仪：美国Nieolet；1260 Infinity液相色谱：安捷伦。

1.3分析方法

黏均分子量：采用测定高分子特征黏度的方法来得到黏均分子量［10］。

蛋白质含量测定：福林酚法［11］。

CS含量测定：采用氯化十六烷基吡啶（Hexadecylpyridinium chloride，CPC）法［11］。

酶解产物高效液相法测定：ZorbaxSAX色谱柱，流速1.0 mL/min，柱温35℃，紫外232 nm检测。流动相A：0.2 mol/L NaCl，pH3.5，流动相B：1.5 mol/L NaCl，pH3.5［12］。

红外吸收光谱：KBr压片，4 000 cm-1～400 cm-1波数范围扫描。

1.4方法

1.4.1硫酸软骨素的分离

取1 kg鲜新秘鲁巨鱿软骨，匀浆后加入1.0 L纯化水，调节pH 7.5～8.0，加入4.0 g（相当于软骨质量的0.4%）木瓜蛋白酶于50℃水解6 h。调节pH 6.0，85℃处理10 min。将水解液离心去除不容物后再用微孔滤膜过滤澄清。

1.4.2硫酸软骨素的纯化

纯化的过程分为超滤浓缩和乙醇沉淀两个部分。超滤选用截留分子量10 kDa的超滤膜进行水解液的浓缩，将料液浓缩到1/2体积。浓缩后的料液加入两倍体积无水乙醇，离心得到硫酸软骨素沉淀，烘干。

2　结果与讨论

2.1鱿鱼硫酸软骨素基本理化性质

精制的CS样品为白色粉末，秘鲁巨鱿软骨硫酸软骨素基本理化性质见表1。

表1　秘鲁巨鱿软骨硫酸软骨素基本理化性质Tab 1 The properties of chondroitin sulfate from Dosidicus gigas cartilage

如表1所示，比旋度为-25.2°，比鲨鱼硫酸软骨素的-12°～-19°大，反而和陆生动物的-20°～-30°范围接近。采用黏均分子量的检测方法，发现秘鲁巨鱿软骨硫酸软骨素的分子量为15.7万，要高于鲨鱼硫酸软骨素（4.5万）和猪硫酸软骨素（2.1万）［13］。秘鲁巨鱿软骨硫酸软骨素的得率为3.2%，较一般陆生动物的低，比如新鲜的猪鼻软骨硫酸软骨素含量就高达10%［3］。

2.2硫酸软骨素二糖构成

秘鲁巨鱿硫酸软骨素酶解高效液相结果见表2和图1。

表2　秘鲁巨鱿软骨硫酸软骨素二糖组成Table 2　Disaccharide compositions of CS from Dosidicus gigas cartilage

图1　秘鲁巨鱿硫酸软骨素酶解物高效液相图Fig.1　Dosidicus gigas cartilage chondroitin sulfate enzymolysis-HPLC

秘鲁巨鱿软骨素中CS-E型二糖含量为17%左右，其余二糖单位的结构与牛硫酸软骨素类似［3］。

2.3红外图谱

秘鲁巨鱿和鲨鱼硫酸软骨素的红外吸收光谱很相似见图2。

图2　秘鲁巨鱿（A）和鲨鱼（B）硫酸软骨素红外光谱图Fig.2　The infared spectrum of CS from Dosidicus gigas and shark cartilage

硫酸软骨素中羟基和氨基的伸缩振动出现在3400 cm-1左右、-CH，-CH2的伸缩振动出现在2 920 cm-1、乙酰胺的弯曲振动出现在1 650 cm-1、羧基的对称伸缩振动出现在1410cm-1、硫酸基特征吸收出现在1230cm-1及820cm-1，1070cm-1～1030cm-1，为硫酸软骨素特征峰。

与鲨鱼硫酸软骨素的红外吸收光谱稍有不同的是，秘鲁巨鱿硫酸软骨素的硫酸基吸收峰1 230 cm-1处稍强，说明秘鲁巨鱿硫酸软骨素中有可能二硫酸化二糖的比例比较高，甚至含有少量三硫酸化的二糖。当硫酸软骨素在与蛋白质或其他细胞组分发生相互反应时，硫酸基起到了非常重要的作用，因此可以预测，相比常见的商品硫酸软骨素，秘鲁鱿鱼软骨硫酸软骨素可能具有更高的生物活性。

3　结论

秘鲁巨鱿软骨硫酸软骨素黏均分子量为157 000，蛋白质含量为4.0%，硫酸软骨素含量为90.4%。目前秘鲁巨鱿产量一直处于增长的状态，从中提取的硫酸软骨素可以成为一种稳定的硫酸软骨素新来源。

酶解高效液相显示秘鲁巨鱿软骨硫酸软骨素中CS-E型二糖单元含量为17%，是一种与鲨鱼、猪、牛硫酸软骨素等市售硫酸软骨素不同的新种类。

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The Properties of Chondroitin Sulfate from Dosidicus gigas Cartilage

LI Yan-ni，GUO Lin，XU Wei-na
（School of Enology，Binzhou Medical College，Yantai 264003，Shandong，China）

The arm of this research was to explore a new sources of chondroitin sulfate.With the purification process of enzymolysis，filtration and ethanol precipitation，chondroitin sulfate（CS）was purified from the cartilage of Dosidicus gigas and characterized in an effort to find alternative source.The yield of CS was about 3.2%，the specific rotation was-25.2°，viscosity-average molecular was 157 000，the E-type disulfated disaccharides was 17%in all CS extracts.The Dosidicus gigas cartilage can be used as a new source of CS.

Dosidicus gigas；chondroitin sulfate；enzymolysis-HPLC；CS（E-type）

2016-05-10

山东省高等学校科技计划（J16LC57）

李燕妮（1980—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：海洋产物分离提取。