二次发酵降低葡萄酒中双乙酰的含量

李　凭，石婷婷，肖冬光（天津科技大学 生物工程学院，工业微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

二次发酵降低葡萄酒中双乙酰的含量

李凭，石婷婷，肖冬光*
（天津科技大学 生物工程学院，工业微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

该文通过在葡萄酒发酵后期添加蔗糖，促使酵母进行二次发酵降低双乙酰的含量。结果表明，二次发酵的最适加糖量为28 g/L，与常规发酵相比，二次发酵后双乙酰含量降低了29.87%；在此基础上，对酵母菌株WY1、WY1-1、WY1-2和WY1-12进行加糖二次发酵试验，测定出4株菌均可降低发酵液中双乙酰的含量，其中菌种WYI-12的发酵液中双乙酰的含量最低，为4.05mg/L，比常规发酵降低了37.21%，改善了葡萄酒的感官质量。

葡萄酒；二次发酵；双乙酰

双乙酰是葡萄酒中一种重要的风味物质。适量的双乙酰会增加葡萄酒的香气，改善葡萄酒的风味。一般情况下，当葡萄酒中双乙酰含量为1～4mg/L时，可增加葡萄酒的口感及风味复杂性，呈现悦人的黄油味或奶酪味；当含量超过5～7mg/L时，就可能产生令人生厌的“馊饭味”，葡萄酒表现变质迹象［1-2］。不同的酒体中双乙酰的感觉阈值有所不同，其不仅与消费者的喜好有很大的相关性［3］，而且很大程度上依赖于葡萄酒中存在的其他成分［4-5］，如MARTINEAU B等［6］报道的红葡萄酒中双乙酰出现“馊饭味”的阈值为10mg/L，而BARTOWSKY E J等［7］报道赤霞珠红葡萄酒双乙酰的阈值为2.8mg/L。由于双乙酰的风味阈值较低，在生产实践中，除了合理的生产工艺，还必须考虑双乙酰的生成途径与消除方法。

双乙酰是丙酮酸到2，3-丁二醇还原过程的中间产物，由α-乙酰乳酸氧化脱羧形成［8］。在葡萄酒酿造过程中双乙酰的产生机制主要有酵母菌主导的酒精发酵和乳酸菌引发的苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）（简称苹-乳发酵）。在酒精发酵过程中，双乙酰的产生主要有3条途径：其一是由糖酵解的中间产物—丙酮酸酶促产生；其二是由α-乙酰乳酸分泌到胞外基质中，由非酶氧化脱羧反应而直接形成［9］；其三是与酵母的缬氨酸生物合成有关［10］。乳酸菌在苹-乳发酵中，L-苹果酸除了转化为L-乳酸外，还转化为丙酮酸，丙酮酸脱羧生成活性乙醛-焦磷酸硫胺素复合物（thiamine pyrophosphate，TPP-C2*），后者再与丙酮酸生成α-乙酰乳酸，经氧化脱羧生成双乙酰；TPP-C2*也可再生成乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA），后者与TPP-C2*结合，直接生成双乙酰［11］。

双乙酰是葡萄酒酿造过程中酒精发酵和苹-乳发酵的副产物，一般只进行酒精发酵的葡萄酒中双乙酰的含量都在阈值以内，但是口感较差。苹-乳发酵能够降低葡萄酒的酸度，增加细菌稳定性的同时，还会增加葡萄酒口味和香气复杂性，改变其风味。而经过苹-乳发酵后，葡萄酒中双乙酰含量会得到很大提高，以至于超过葡萄酒规定的阈值。酿酒酵母不仅具有双乙酰的合成能力，还有较强的还原能力［12］，将双乙酰还原为乙偶姻，进一步还原成2，3-丁二醇，后两者在葡萄酒中的感官阈值很高，分别为150mg/L和600mg/L，因此对葡萄酒风味影响不大［13］。本研究旨在不改变葡萄酒苹-乳发酵特征的基础上，进一步降低葡萄酒中双乙酰的含量。通过在葡萄酒后期发酵过程中添加蔗糖，使酵母进行二次发酵的方法降低双乙酰的含量，同时比较不同菌株采用加糖二次发酵后双乙酰的降解效果，筛选发酵性能良好并且可降低双乙酰含量的优良菌株，以更好地提高葡萄酒的风味质量。

1　材料与方法

1.1料与试剂

1.1.1株

葡萄酒酵母（Saccharomyces ellipsoideus）WYI、WYI-1（WYI改造菌株，过表达双乙酰还原酶基因bdh1）、WYI-2（WYI改造菌株，过表达双乙酰还原酶基因bdh2）和WYI-12（WYI改造菌株，同时过表达双乙酰还原酶基因bdh1和bdh2）、乳酸菌（lactic acid bacteria）：工业发酵微生物教育部重点实验室保藏。

1.1.2养基

种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextract peptonedextrose，YEPD）培养基：葡萄糖2.0%，蛋白胨2.0%，酵母粉1.0%，pH 6.0。

1.1.3料及化学试剂

玫瑰香葡萄：天津汉沽葡萄园；蔗糖：上海试剂二厂；邻苯二胺（分析纯）：天津市四通化工厂；双乙酰（98%）：天津市化学试剂一厂；浓盐酸（38%）：北京化工厂。

1.2器与设备

UVm ini-1240分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司；ETT-SYXZL双乙酰蒸馏装置、IS-RDS3恒温摇床：上海制成仪器制品有限公司；JW-JJJ-3酒精计：天津市津武仪器仪表有限公司；pHSJ-4A型实验pH计：上海科学仪器有限公司；PERKIN ELMERAutosystem气相色谱仪：北京安捷伦科技有限公司。

1.3法

1.3.1萄酒加工工艺流程

操作要点：将葡萄分选除杂后进行破碎除梗，同时加入50～100mg/L SO2（添加量根据葡萄的损坏程度而定），用蔗糖调整葡萄浆的糖浓度，固定pH值为3.3，接入5%酵母菌，在25℃条件下进行酒精发酵4 d，发酵液进行皮渣分离后，接入5%乳酸菌，于18℃进行苹-乳发酵，为启动酵母二次发酵，在苹-乳发酵4 d后于发酵液中添加蔗糖（添加量和前期蔗糖添加量总和为210 g/L），二次发酵4 d后结束发酵，对发酵液进行过滤、贮存后杀菌装罐。

1.3.2次发酵加糖量的确定

葡萄酒发酵时，葡萄汁含糖量必须在17%以上才能生成10%vol的酒，只有10%vol以上的酒才能保存长久。如糖分不足，则需要人为提高原料的含糖量，从而提高葡萄酒的酒精度。一般要求葡萄汁的初始糖含量≥200 g/L，在常规葡萄酒发酵过程中，一般将葡萄汁的初始含糖量调整为210 g/L。为确保葡萄酒发酵液的残糖和酒精度在规定范围内，以及验证酵母在二次加糖后是否启动二次发酵，故在加糖二次发酵时，使初始糖含量和二次加糖量的总量仍为210 g/L。

按照表1，将葡萄汁初糖含量分别调至相应的值，于25℃条件下接入酵母WY1进行酒精发酵，对发酵液进行皮渣分离，接入乳酸菌进行苹-乳发酵，待后发酵4 d后，按表1于发酵液中加入蔗糖进行发酵。通过测定发酵液中的残糖量、酒精度和双乙酰含量，以确定葡萄酒二次发酵的最适加糖量。

表1　葡萄酒二次发酵加糖量Table 1 Sugar addition during w ine secondary ferm entation

1.3.3同菌株加糖发酵试验

按照1.3.1对葡萄汁成分进行调整之后，将待筛选菌株WYI、WYI-1、WYI-2和WYI-12分别加入发酵液中进行葡萄酒常规发酵和加糖二次发酵，测定两种发酵方式条件下各发酵液的基本酿造指标（pH值、总酯含量和风味物质），并进行比较，同时测定加糖二次发酵后各发酵液中双乙酰的含量。

1.3.4析方法

酒精度采用酒精计法测定［14］；残糖量的测定采用菲林试剂法测定［14］；pH值采用pH计测定；总酯含量的测定采用皂化法测定［14］；风味物质采用高效气相色谱法测定；双乙酰含量的测定采用邻苯二胺比色法［15-16］。

2　结果与分析

2.1次发酵加糖量的确定

2.1.1次加糖量对葡萄酒残糖量和酒精度的影响

以二次发酵不加糖的发酵液作为对照，在不同的加糖量条件下进行葡萄酒发酵试验。为验证葡萄酒发酵前期和加糖后酵母的发酵能力以及加糖量对葡萄酒发酵的影响，分别在前期发酵结束后（第4天）和加糖二次发酵结束后（第12天）测定发酵液中的残糖量和酒精度，以确定葡萄酒二次发酵的最适加糖量，二次发酵中加糖量对葡萄酒残糖量和酒精度的影响结果分别见表2和表3。

表2　二次发酵中加糖量对发酵液残糖量的影响Table 2 Effect of sugar addition on residual sugar of fermentation liquid in seconda ry ferm entationg/L

由表2可知，随着二次加糖量的增多，初始加糖量的减少，最后发酵液的残糖量呈现由小变大的趋势。当二次加糖量为42 g/L和56 g/L时，与二次发酵不加糖的发酵液相比，发酵液中残糖量明显增加，说明二次加糖后酵母几乎没有发酵。后期发酵乳酸菌会消耗一部分蔗糖使酒精度下降，同时由于后期发酵温度较低，酵母菌酒精发酵速度慢，也会导致发酵液残糖偏高。

表3　二次发酵中加糖量对发酵液酒精度的影响Tab le 3 Effect of sugar addition on alcohol content of ferm entation liquid in secondary ferm entation

由表3可知，当二次加糖量为14 g/L和28 g/L时，与前期发酵相比，发酵后的酒精度有所增加。随着二次加糖量的增多，初始加糖量的减少，二次发酵液的酒精度呈现由大变小的趋势。这可能是由于初始加糖量较少，酵母可利用的糖不足，酵母发酵能力弱，即使在后期发酵过程中加糖，激活起来的酵母量也相应较少，使后期加的糖不能被利用而积累到最后，导致最后酒精度明显降低。

结果表明，按照国标GB 15077—2006《葡萄酒》干型葡萄酒的要求（残糖量≤4.0g/L，酒精度在8.5%vol～15.0%vol）内。因此，综合考虑，初步确定二次发酵加糖量为14 g/L和28 g/L。

2.1.2糖二次发酵与常规发酵双乙酰含量比较

在前期发酵及加糖二次发酵（第12天）结束后测定两种加糖量条件下发酵液中双乙酰含量，并与不加糖常规发酵进行比较，确定葡萄酒二次发酵的最适加糖量，结果见图1。

图1　二次发酵加糖量对发酵液中双乙酰含量的影响Fig．1 Effectof sugar addition on diacetylcontentof fermentation liquid in secondary fermentation

由图1可知，加糖二次发酵后，发酵液中双乙酰含量比常规苹-乳发酵明显降低，其中常规发酵时发酵液双乙酰含量为11.35mg/L，二次加糖量为14 g/L和28 g/L时，发酵液中双乙酰含量分别为9.72mg/L和7.96mg/L，与常规苹-乳发酵相比，双乙酰含量分别降低了14.36%和29.87%。后期加糖使酵母产生二次发酵，提高了其对发酵液中双乙酰的还原活性，使双乙酰含量降低。加糖量为28 g/L与14 g/L相比，较多的糖用于后期发酵，使酵母二次发酵更充分。同时，当酵母与乳酸菌同时发酵时，二者具有相互抑制的作用，酵母对双乙酰还原的同时，还使得乳酸菌代谢的双乙酰量较少。故确定二次发酵的最适加糖量为28 g/L。

2.1.3糖二次发酵与常规苹-乳发酵发酵的常规指标的比较

为考察加糖二次发酵对葡萄酒中其他酿造指标的影响，按照方法1.3.4对该加糖量条件下的发酵液的pH值、总酯和风味物质进行测定，并与酒精发酵后和常规苹-乳发酵后的相应指标进行比较。结果见表4。

表4　葡萄酒pH值、总酯含量和风味物质的测定Table 4 Determination of pH，totalester contentand flavor com pounds in w ine

由表4可知，加糖二次发酵后发酵液中pH值、总酯含量和风味物质含量与常规发酵相比略有偏差，但变化不大。葡萄酒中乳酸菌发酵可以起到降酸的作用，在发酵后期加糖后促使酵母进行二次发酵，对乳酸菌有一定的抑制作用，使最后发酵液的pH值与常规苹-乳发酵相比略有增大，但影响不大。后期乳酸菌发酵在调节发酵液“酸碱平衡”的同时，其代谢活动也会改变葡萄酒中的酯类和一些高级醇等风味物质的含量，对葡萄酒的风味起到一定的修饰作用，提高葡萄酒的风味复杂性。加糖量为28 g/L的加糖二次发酵综合了酒精发酵和常规苹-乳发酵的优势，既降低了葡萄酒中双乙酰的含量，又使葡萄酒的粗糙、酸涩等特征消失，提高了葡萄酒的风味质量。

2.2产双乙酰葡萄酒酿酒酵母的筛选

2.2.1同菌株对双乙酰含量的影响

以葡萄酒酵母WYI作为对照，考察改造菌株WYI-1、WYI-2和WYI-12加糖二次发酵后对发酵液中双乙酰含量的影响，结果见图2。

图2　不同菌株对葡萄酒发酵双乙酰含量的影响Fig.2 Effectof different strains on diacetyl contentofw ine

由图2可知，葡萄酒酵母WYI、WYI-1、WYI-2和WYI-12在加糖二次发酵后，发酵液中双乙酰含量分别为7.60mg/L、4.57mg/L、5.06mg/L和4.05mg/L。与常规发酵相比分别降低了33.04%、41.63%、41.43%和37.21%；改造菌株与菌株WY1相比，在加糖二次发酵的基础上，改造菌分别使双乙酰含量进一步降低了39.87%、33.42%和46.71%。由于改造菌株在WY1的基础上提高了双乙酰还原酶的还原能力，可使双乙酰更多的还原为乙偶姻和2，3-丁二醇。改造菌WYI-1、WYI-2和WYI-12均能更好的加快双乙酰的降解，其中菌株WY1-12的降解效果最好。

2.2.2同菌株二次发酵性能的比较

以菌株WY 1作为对照，分别考察突变菌WY 1-1、WY 1-2和WY1-12发酵后对葡萄酒酿造指标的影响，结果见表5。

由表5可知，菌株WY1-1经加糖二次发酵后发酵液的残糖量、酒精度、pH值及其中的总酯和风味物质与菌株WY 1发酵结果基本一致；菌株WY 1-2发酵后发酵液的残糖量、酒精度和pH值与菌株WY1相差不大，但总酯和风味物质明显降低。而突变株WY1-12发酵后发酵液的残糖量和pH值降低，酒精度升高的同时，总酯和风味物质含量明显升高，由于酯类也是葡萄酒中的重要风味物质，较多的酯类有助于提高葡萄酒的风味，且风味物质在葡萄酒的呈香过程中起到至关重要的作用。故综上可得，菌株WY1-12的发酵性能较好。

表5　不同菌株对葡萄酒酿造指标的影响Tab le 5 Effectof different strains on brew ing indexes in w ine

3　结论

本研究通过在葡萄酒常规苹-乳发酵的基础上，于葡萄酒后期发酵过程中添加蔗糖，使酵母菌进行二次发酵降低双乙酰的含量。结果表明，加糖二次发酵的最适加糖量为28 g/L，与常规发酵相比，该加糖量下进行二次发酵后双乙酰含量降低了29.87%。在此基础上对菌株WY1改造后提高了双乙酰还原酶活力的菌株WY1-1、WY1-2和WY 1-12进行葡萄酒发酵试验，筛选出一株发酵性能良好并且对双乙酰降解效果较好的菌株WY 1-12，与菌株WY 1相比，在加糖二次发酵的基础上，该菌使双乙酰含量进一步降低了46.71%，并且对发酵液的其他酿造指标没有显著影响。加糖二次发酵综合了酒精发酵和苹-乳发酵的优势，既降低了葡萄酒中双乙酰的含量，同时使葡萄酒的粗糙、酸涩等特征消失，使酒变得圆润、柔和，对提高葡萄酒的风味质量具有十分重要的意义。

［1］BARTOWSKY E I，HENSCHKEPA.The'buttery'attribute ofw ine diacetyldesirability spoilage and beyong［J］.Int J Food M icrobiol，2004，96（3）:235-252.

［2］屈慧鸽，肖波，冯志彬，等.葡萄酒酿造过程中双乙酰的形成因素分析［J］.食品科学，2010，31（3）：293-296.

［3］MALHERBE S，MENICHELLIE，DU TOITM，et al.The relationships between consumer liking，sensory and chemicalattributesof VitisviniferaL.cv.Pinotagew ines elaborated w ith different Oenococcus oeni starter cultures［J］.J Sci Food Agr，2013，93（11）:2849-2840.

［4］BARTOWSKY E J，HENSCHKE PA.Managementofmalolactic fermentation for the‘buttery’diacetyl flavourinw ine［J］.Aust G rapeW ine，2000，438a:58-67.

［5］MARTINEAU B，ACREE T E，THOMAS H K.Effect of w ine type on thedetection threshold fordiacetyl［J］.Food Res Int，1995，28（2）139-143.

［6］MARTINEAU B，THOMASH K，ACREE T E.Ressessmentof the influence ofmalolactic fermentation on the concentration of diacetyl inw ines［J］.Am J Enol Viticult，1995，46:385-388.

［7］BARTOWSKY E J，FRANCISIL，BELLON JR，etal.Isbuttery aroma perception in w ines predictable from daicetyl concentration？［J］.Aust J GrapeW ine R，2002，8（3）:180-185.

［8］MARTINEAU B，THOMASH K.Performance and diacetyl production of commercialstrainsofmalolactic bacteria inwine［J］.Appl Bacteriol，1995，78（5）:526-536.

［9］DUONGC T，STRACK L，FUTSCHIK M，etal.Identification of Sc-type ILV6 asa target to reduce diacetyl formation in lagerbrewers’yeast［J］. Metab Eng，2011，13（6）:638-647.

［10］KRISTOFFER K，BRIAN R G.Influence of valine and other am ino acidson total diacetyland 2，3-pentanedione levels during fermentation of brewer’swort［J］.App l M icrob iol Biotechnol，2013，97（15）:6919-6930.

［11］CHOPIN A.Organization and regulation of genes for am ino acid biosynthesisin lactic acidbacteria［J］.FEMSM icrobiol Reviews，1993，12（1-3）:21-37.

［12］ROMAN M，STEPHAN S，KÖLLING R，et al.Diacetyl reduction by commercial Saccharomyces cerevisiae strainsduring vinification［J］.J I Brewing，2014，120（1）:23-26.

［13］李华，王华，袁春龙，等.葡萄酒化学［M］.北京：科学出版社，2005.

［14］蔡定域.酿酒工业分析手册［M］.北京：轻工业出版社，1988.

［15］徐大号.测定啤酒中双乙酰含量的改进EBC法［J］.中国酿造，2004，23（6）：36-38.

［16］周生民，焦健，葛新霞，等.啤酒发酵过程中有害菌对双乙酰含量影响的分析［J］.中国酿造，2011，30（10）：158-159.

Reduction of diacetyl inw ine through secondary fermentation

LIPing，SHITingting，X IAO Dongguang*
（Tianjin Key Laboratory of IndustrialM icrobiology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry ofEducation，College ofBiotechnology，Tianjin University ofScienceand Technology，Tianjin 300457，China）

Diacetyl content was reduced through yeast secondary fermentation w ith sugar addition into w ine during post fermentation.The results showed that the diacetyl content reduced by 29.87%at theoptimum sugar content28 g/L during secondary fermentation.On thebasisof theoptimum sugar content，the secondary fermentation of w inew ith sugar addition was carried outw ith yeast strainsWYI，WYI-1，WYI-2 and WYI-12.The experiments results indicated that four strains all could reduce the diacetyl content in fermentation liquid.The diacetyl content in strainWYI-12 fermentation liquid was the lowest（4.05mg/L），reduced 37.21%com pared w ith the conventional fermentation，which im proved sensory quality ofw ine.

w ine；secondary fermentation；diacetyl

Q815

0254-5071（2016）01-0115-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．025

2015-11-05

天津市科技支撑计划（15ZCZDNC00110）

李凭（1990-），女，硕士研究生，研究方向为现代酿造技术。

肖冬光（1956-），男，教授，博士，研究方向为现代酿造技术。