食品加工过程中细菌生物被膜的危害及控制

陈小雪，陈晶瑜，韩北忠（中国农业大学 中国农业大学 食品科学与营养工程学院食品质量与安全北京实验室，北京 100083）

食品加工过程中细菌生物被膜的危害及控制

陈小雪，陈晶瑜，韩北忠*
（中国农业大学 中国农业大学 食品科学与营养工程学院食品质量与安全北京实验室，北京 100083）

生物被膜中的微生物生活在一个由胞外聚合物（EPS）形成的环境中，它的形成是微生物生长过程中的一个保护模式，允许细胞在恶劣的环境中生存并分散到新的环境中。食品加工过程中有害菌形成的生物被膜对食品工业的危害极大，可使微生物残存增加，加工设备无法严格清洗、消毒，导致产品受到污染。该文在收集、研究现有文献的基础上归纳介绍了生物被膜的特点及其形成过程和形成机制，概述了生物被膜的危害、控制及检测方法，旨在提高人们对生物被膜的认识，推动该领域的研究发展。

细菌生物被膜；形成；食品加工；危害；调控机制

Keywors: bacterialbiofilm；formation；food processing；hazards；regulatorymechanism

近年来，由于生物被膜导致的安全问题越来越多的被报道，它严重威胁到了人类的健康问题，因此受到科学家们的广泛关注。在医学上，牙菌斑中及人体内植入器械上的生物被膜因其对人类健康的危害而得到了广泛的研究。而在食品工业中，生物被膜除了能够腐蚀管道和金属表面外，更可导致动植物及人类疾病发生［1］。本综述在介绍什么是生物被膜的基础上阐述了其对人类的具体危害，并对当前生物被膜的控制方法和检测方法做了概述。

1　生物被膜的定义和特点

生物被膜（biofilm，BF）是指粘附于接触表面，分泌胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS），将自身包绕其中而形成的微生物群落［1］，它是细菌等微生物在自然界中存在的主要形式。20世纪30年代中期，COSTERTON JW等［2］对口腔中牙菌斑生物被膜细菌和龋齿的关系做了大量的研究，为深入了解生物被膜在健康和疾病中的作用奠定了基础。近年来生物被膜相关的研究在国内逐渐受到重视，但国内学者对它的命名并不统一，唐俊妮等［3-4］将其翻译为“生物膜”和“生物菌膜”，韩北忠等［5-6］将其翻译为生物被膜。生物学上的生物膜（biomembrane）是指镶嵌有蛋白质和糖类的磷脂双分子层，起着划分和分隔细胞和细胞器作用，也是与许多能量转化和细胞内通讯有关的重要部位，是细胞、细胞器和其环境接界的所有膜结构的总称。显然，将biofilm翻译为生物被膜更为合适。

随着近年来对生物被膜研究的不断深入，学者们发现自然界中的生物被膜毫无例外地是由混合微生物形成的。生物被膜中的成分十分复杂，含有细菌、细菌分泌的大分子多聚物（如蛋白质、多糖、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、肽聚糖、磷脂等）、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等［7-8］。DAVIESD G等［9］在应用激光共聚焦扫描显微镜技术研究生物被膜结构的过程中发现生物被膜呈独特的三维立体结构，而细菌在生物被膜总体积中只占不到1/3，其余大部分都是由细菌分泌的胞外多糖和其他粘性物质等。生物被膜的分布十分广泛，在适宜细菌生长的各种物体表面均可发现，同时，生物被膜加强了微生物对于不利环境的抗性，使其难以被酸、碱、强氧化剂及抗生素等清除［10］。因此，对生物被膜的形成机理及去除机制的研究尤其重要。

2　生物被膜的形成过程

近年来，越来越多的国内外专家学者致力于研究生物被膜形成的机制，让我们对于生物被膜的认知也不断加深。现在，学界普遍认为生物被膜的形成经历了三个阶段：粘附期、发展期和成熟期。这三个阶段中生物被膜经历了从浮游态到粘附结构态，从低密度到高密度的过程，这个过程是由多种基因共同调控的结果［11］。微生物细胞从浮游态到成熟的生物被膜态的发展过程见图1。

图1　微生物细胞从浮游态到成熟的生物被膜态的发展模拟图［15］Fig．1 Models of the development of a m ature biofilm from planktonic cells［15］

2.1附期

浮游态的细菌粘附到含有蛋白质等营养物质的材料表面。此过程中细菌表面特定的粘附蛋白特异性地识别生物材料表面的受体，产生的附着力让细菌在接触表面固定［12-14］。根据细菌粘附在材料表面的原理不同，此粘附过程可分为可逆粘附和不可逆粘附。浮游细菌首先在流体或是自身鞭毛的作用下接触到材料表面，同时其他附着结构识别该材料使其固定于材料表面，此时的粘附为可逆粘附。随后微生物通过分泌的胞外多聚物使其牢固地附着于材料表面，此时的粘附为不可逆粘附。当生物被膜处于粘附期时，它的状态相对不稳定，可以通过冲洗、加热等物理方法清除生物被膜。

2.2展期

细菌大量分泌胞外多聚物粘附单个细胞是生物被膜不断壮大。此过程中细菌开始大量繁殖，同时调整基因表达产生大量的胞外物质，让分裂产生的细菌及接触到的环境中的其他细菌一并粘附在此生物被膜中，让生物被膜不断加厚成熟，增强其对于不利环境的抗性［15］。

2.3熟期

生物被膜中的部分细菌溶解脱落下来，重新转移粘附到材料表面形成新的生物被膜。此过程中，细菌产生了大量的胞外多聚物，形成稳定的致密的成熟的生物被膜。此阶段，生物被膜内部的结构组成不是均匀的，而是在该结构中新老交替的菌落共植体。生物被膜中的细菌在时间上和空间上的多样性，是其均有强大的抗逆性的基础之一。同时生物被膜中的微生物菌落间可以进行水分、营养物质、代谢产物等的运输［16］。此时的生物被膜已经发育成熟，生物被膜中的部分细菌在其内部的调节机制或在外部冲刷等作用下可以从生物被膜结构中脱落出来，在适当的条件下重新转移粘附到材料表面产生新的生物被膜结构。成熟期的生物被膜已经十分稳定，对环境中不利因素的耐受能力也达到最强。

3　细菌生物被膜形成及主要调控机制

细菌开始形成生物被膜的重要原因之一是以其菌毛通过非特异性的电引力或疏水作用与材料表面相结合［17］。这个过程使细菌黏附在宿主表面是其形成生物被膜的第一步，主要是通过细菌表面特定的粘附素蛋白识别宿主表面受体而形成黏附，因此具有选择性和特异性［18］。

在细菌生物被膜的形成过程中，细菌的群体感应系统（quorum sensing system，QS）发挥着重要的作用。随着细菌的代谢和繁殖，细菌在代谢过程中释放自诱导物到周围环境中，菌体密度增加，菌体产生的自诱导物的浓度也在增加。当周围环境中自诱导物浓度达到一定阈值时，就会激活细菌表面或内部的受体，转化为细菌胞内代谢的生化信号，从而诱导细菌特定基因表达，使细菌产生适应性的生理变化，这种适应性变化行为包括进行DNA复制、细胞繁殖、形成生物被膜、产生致病因子以及形成孢子等，这种调控行为被称为群体感应［19］。

与细菌生物被膜形成有关的群体感应系统主要有3类：酰基高丝氨酸内酯（acyl-homoserine lactone，AHL）密度感应系统又称Ⅰ型自诱导物（autoinducter-1，AI-2）密度感应系统、小分子多肽自诱导物（autoinducter peptide，AIP）密度感应系统以及Ⅱ型自诱导物（autoinducter-2，AI-2）密度感应系统［19］。在不同的密度感应系统的调控作用下，不同细菌分泌的自诱导物也不同。革兰氏阴性细菌一般利用酰基高丝氨酸内酯（AHL）类分子作为信号因子；革兰氏阳性细菌—般利用寡肽类分子（AIP）作为群体感应调控过程中的信号因子。另外，许多革兰氏阴性和阳性细菌都可以产生一种AI-2的信号因子，一般认为AI-2是一种不同种间细胞交流的通用信号分子。最近有研究发现，在生物被膜的形成过程中有些细菌可以同时利用两种甚至3种不同信号分子调节自身群体行为［20］，这说明细菌的群体感应机制是极为复杂的。

4　生物被膜在食品加工过程中的危害

在食品工业中生物被膜的研究主要集中在肉制品、乳及乳制品等领域。研究表明，几乎所有的细菌在一定条件下都可以形成生物被膜。而引起食品污染机会较多的沙门氏菌属（Salmonella）、大肠杆菌（Escherichia coli）、李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）等常见的食源性致病菌，在环境中普遍存在，他们在一定的条件下也能形成不易去除的生物被膜［21］。细菌黏附在食品、各种食品加工接触面及非食品加工接触面（如墙壁、下水道、死角等地方）后形成生物被膜，再经手或空气等途径污染食品从而引起食物中毒［21-22］。由于其难以去除的特性，即使在食品加工中经过严格的清洗消毒工序，微生物生物被膜还有可能逗留在食品接触表面并危害食品安全。因此，控制食品中各种致病菌及条件致病菌的污染，特别是防止其形成生物被膜交叉污染食品，是控制食源性疾病发生的重要内容之一。

5　生物被膜的控制方法

根据生物被膜形成的过程，常见的控制生物被膜的方法主要有三类，分别是阻止微生物粘附、抑制生物被膜的形成以及清除已经形成生物被膜。常见的手段包括物理方法（刮、擦、高压水流冲洗等）、化学方法（抗生素、杀菌剂和天然抑菌成分等）和生物学方法（分子生物学手段等）。

去除生物被膜常见的物理方法有超高磁场、超声波处理、高脉冲电场、低电场等［5］，这些方法都是通过不同的物理原理，达到去除生物被膜的目的。杨葆华等［23］用优化的超声波法，利用超声波的“空化”效应，设定超声波功率135W，处理时间14min，处理温度35℃，可将生物被膜从接触表面有效得充分剥离，实验效果优于平板擦拭法。DEL POZO JL等［24］证明了应用低强度的电流能够增强抗菌剂对生物被膜的抗菌活性。VLEUGELSM等［8］研究发现，常压等离子体技术对细菌形成的生物被膜具有杀菌作用，该技术是利用高压放电在低气压状态下发生辉光放电产生活性氧和自由基来灭活微生物，对生物被膜中的微生物同样有杀灭作用。NIEM IRA B A等［25］认为电离辐射是一种有效的去除生物被膜的物理方法，对食品接触的卫生设备表面生物被膜及其相关的细菌有良好的去除及杀灭作用。

陈秋云等［26］研究了常用杀菌剂对生物被膜的作用，发现生物被膜形成过程中细胞代谢产生的一些有机物质对杀菌剂的杀菌效果影响较大，这可能是导致生物被膜态细菌比浮游态细菌对杀菌剂的抗性大的原因。CHAW K C等［27］研究发现，离子状态的银离子可以与生物分子的供电子基团表面结合，从而通过减小生物被膜基质与胞外多聚物的分子间作用力来减少生物被膜的黏附作用。SCHLAG S等［28］证实了5mmol/L的亚硝酸盐能有效地抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。孙纪录等［29］证实了电解水对金黄色葡萄球菌生物被膜有良好的去除作用。另外，一些天然提取物作为新的杀菌剂也具有抑制生物被膜形成的能力，以及医学上使用的一些抗生素（如阿奇霉素、万古霉素等），都已被证明对金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物被膜及被膜中的菌有杀灭作用［30-31］。

6　生物被膜的检测方法

由于生物被膜的特点，决定了其检测方法应快速、灵敏、准确、简便，这样才能更有效地控制由生物被膜引起的食品污染，防止食源性疾病的发生。目前检测细菌生物被膜的方法主要有平板法、银染法、玻璃管法、结晶紫染色法、生物发光法和荧光显微镜法等［32］。近年来，随着分子生物技术的迅速发展，一些新的检测方法也逐步发展起来，如PCR鉴定、肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探针荧光原位杂交技术等［33］。由于分子生物学方法在生物被膜形成机制方面研究上的应用，有研究表明生物被膜的形成与某些特定的基因相关，通过PCR技术可以快速、准确地诊断出是否存在决定生物被膜形成的基因［34］。这些方法中最常用的还是传统的染色法和显微镜法。随着显微镜技术的发展，扫描电镜（scanning electronmicroscope，SEM），激光共聚焦显微镜（scanning laser confocalmicroscope，CLSM）等较为先进的显微技术可以直接检测生物被膜表层的形态学，对于细胞间的连接结构可清楚地辨别，其中CLSM还可用于生物被膜立体结构的形态学研究。

随着研究的不断深入和飞速发展，用于生物被膜形成能力的检测方法的种类也越来越多，但这些检测方法仍有许多缺陷。因此，在实际的研究过程中，一般都会结合几种方法对生物被膜进行检测，从而提高检测的准确度。

7　结语

与浮游态细菌相比，生物被膜有着更复杂的结构、更广泛的信息沟通和更精密的调控机制，这就导致了其在人们的日常生活中更难以对付。目前关于细菌生物被膜的研究主要集中在污水处理、医药领域、生物工程材料、食品加工与安全等学科［32］。今后的研究方向应集中在生物膜形成的调节机制与生物被膜的控制技术等领域。利用基因芯片、基因敲除等分子技术，结合核磁共振等代谢组学分析技术，以及原子力术、激光共聚焦等先进的显微镜呈像技术等，从基因组水平、代谢组学水平及实际空间结构等分析，构建生物被膜模型。通过这几个方向的综合研究，可以明确不同时期生物膜形成的结构及其形成的代谢机理，为建立有效的生物膜去除和预防策略将奠定理论基础。

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Hazard and control of bacterial biofilm during the food processing

CHEN X iaoxue，CHEN Jingyu，HAN Beizhong*
（Beijing Laboratory forFood Quality and Safety，College ofFood Science&Nutritional Engineering，China AgriculturalUniversity，Beijing 100083，China）

The microorganisms in biofilms live in amatrix of extracellular polymeric substances（EPS）that form their immediate environment. Biofilm formation represents a protected mode of growth that allows cells to survive in hostile environments and also disperses to colonize new niches，causingmore serious biological hazards to food industry.Biofilm would increase survival rate ofm icroorganism，therefore，it is difficult to clean and sterilize，causing food contam ination.This paper introduced the characters and the formation process of biofilms and discussed the formationmechanism of biofilms，summarized the hazard and control and detectionmethodsof biofilm，in order to improve people'sunderstanding ofbiofilm and promote the research developmentin the field.

R155．5

0254-5071（2016）01-0001-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．001

2015-12-09

国家自然科学基金（31371716）

陈小雪（1988-），女，博士研究生，研究方向为食品微生物学。

韩北忠（1961-），男，教授，博士，研究方向为食品微生物学与发酵工程。