新疆动物原奶中肠球菌抗生素耐药性分析

张　潇，周兴雅，倪永清（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

新疆动物原奶中肠球菌抗生素耐药性分析

张潇，周兴雅，倪永清*
（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

采用K-B纸片扩散法对从新疆常见食用性动物原奶中筛选出的17株肠球菌（Enterococcus spp.）进行10种抗生素耐药性检测。耐药谱结果显示，17株肠球菌对新霉素和卡那霉素均为100%敏感；对链霉素耐药率较高，为94.12%；对其余7种抗生素均表现出不同程度的耐药性，对萘啶酸和四环素的耐药率分别为35.29%和23.53%；对利福平、红霉素、头孢噻肟和氨苄西林等抗生素敏感或中度敏感。其中超过50%的菌株能耐受4～5种抗生素，表明新疆地区少数民族食用乳品中肠球菌均存在耐药性，部分肠球菌具有多重耐药，仍需进一步对肠球菌耐药传播进行监测。

原奶；肠球菌；抗生素耐药性

抗生素又称抗菌素，是细菌、真菌等微生物产生的代谢产物，对特异微生物具有抑制或杀灭作用［1］。20世纪初期抗生素诞生以来，越来越多的抗生素被发现并广泛应用于医疗、兽医以及动物饲料等行业，其广泛使用使得感染性疾病得到了有效控制，但随之而来的细菌耐药性问题已日益凸显且备受关注，细菌耐药性的广泛传播和多重耐药菌株的出现已成为严重的公共卫生问题。

近年来国内外大量研究表明，由于抗生素的不正当使用及滥用现象，长期以来被认为安全的、广泛应用于发酵食品领域的乳酸菌已经产生耐药并携带了相应的耐药基因，并随着人类大量应用抗菌素，这些益生菌可能成为抗菌素抗性基因的病原库［2］。肠球菌（Enterococcus sp.）是人体正常的定殖菌，作为典型的乳酸菌，是部分食品的重要微生物菌群，在传统原奶发酵也是优势种群，同时又为医院内感染的常见致病菌［3］。作为发酵乳制品发酵剂的肠球菌一旦具有耐药性或者携带耐药基因，就可能随着人们的饮食而进入人体的胃肠道中，通过水平转移进而传递给其他肠道菌株，甚至是有害菌，最终导致有害菌对相应抗生素的耐药性［4-5］。FRANZ等对来自于发酵乳中的肠球菌进行了耐药性测定，发现所有菌株主要对阿莫西林和万古霉素等抗生素敏感［6］。目前，除了发现抗青霉素和万古霉素的肠球菌外，还发现了抗氨苄青霉素、氯霉素、四环素、红霉素、环丙沙星、链霉素和庆大霉素的肠球菌，具有广谱耐药性的肠球菌还尚未发现［7-10］。

新疆以放牧为生的少数民族数量较多，居住也较为分散，然而随着和外界生活的接轨，抗生素的使用也在逐渐增多，来源于人和牲畜的医用药物也逐步改变着当地的生态环境。为了解新疆各地原生态奶制品品质及肠球菌的安全问题，本研究通过大量采集新疆北部地区各少数民族动物原奶样品，通过稀释涂皿法分离肠球菌，采用K-B纸片扩散法对所得肠球菌进行10种抗生素耐药性检测分析，以期为动物肠球菌抗生素耐药性的研究提供理论依据。

1　材料与方法

1.1料与试剂

1.1.1品来源

大量采集新疆北部阿塔城地区、阿勒泰地区、博乐地区、伊犁地区不同少数民族（维吾尔族、哈萨克族、蒙古族、回族）牧民家养牲畜（牛、羊、马、骆驼）原奶样品。

1.1.2要试剂

链霉素（streptomycin，STR）、四环素（tetracycline，TET）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、利富平（rifampicin，RIF）、红霉素（erythromycin，ERY）、新霉素（neomycin，NEO）、头孢噻肟（cefotaxime，CTX）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、氨苄西林（ampicillin，AMP）、萘啶酸（nalidixic acid，NAI）：加拿大BBI公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.3菌株

17株肠球菌分离自新疆北部地区各少数民族动物原奶样品；质控菌株产肠毒素大肠埃希氏菌（Enterotoxigenic Escherichiacoli，ETEC）10421、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）10420：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（china centerof industrial culture collection，CICC）。

1.1.4养基

改良MRS培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸提物5 g，柠檬酸二胺2 g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，吐温-80 1m L，蒸馏水1 000m L，pH 6.2～6.4；用于肠球菌的分离纯化及药敏试验的基础培养基。

1.2器与设备

Freesco21型高速冷冻离心机：美国Thermo公司；CX21光学显微镜：日本Olympus公司；Tprofessional聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Biometra公司；GelDOC XR凝胶成像系统、PowerPacUniversal水平电泳仪、电泳槽：美国Bio-Rad公司；UVm ini-1240紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.3验方法

1.3.1球菌的分离纯化

将原奶样品采用梯度稀释法涂布于改良MRS培养基上，37℃培养48 h，根据菌落形态、大小、颜色、凹凸等表型特征进行初步筛选并纯化菌株，然后对纯化菌株进行革兰氏染色鉴定，在显微镜下观察其形态和革兰氏染色特征，确定菌株种类。

对革兰氏阳性、球状的分离菌进一步通过测定16S rRNA进行确定，扩增16S rRNA基因上下游引物为27f：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3和1492r：5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，扩增条件参考文献［11］进行，PCR产物由上海生工生物科技有限公司进行测序。

1.3.2敏纸片琼脂扩散法分析肠球菌的耐药谱

根据美国临床实验室标准化委员会标准2005版的规定采用药敏纸片琼脂扩散法（K-B法）进行耐药性测定，将纯化的肠球菌新鲜培养物定量接种于MRS固体培养基37℃培养48 h，挑选形态相同的菌落移种于MRS液体培养基，置于37℃培养箱中孵育4 h，校正浊度。取经过分装的菌液（经测试验菌种活菌数目为1×108～3×1010CFU/g），用无菌生理盐水逐级稀释至实验所需浓度（1×107CFU/g、1×108CFU/g、1×109CFU/g），混匀后备用。

将制备好的菌悬液用灭菌的棉拭子蘸取，均匀涂布在整个培养基表面，放置10min后，待平板上水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子将药敏纸片紧贴于培养基表面，35℃厌氧/需氧培养，18～24 h后，测定抑菌圈直径大小，参照美国临床和实验室标准协会（clinicaland laboratory standards institute，CLSI）标准将肠球菌对抗菌药物的敏感性定义为敏感（sensitivity，S）、中介（intermediary，I）和耐药（resistance，R），抑菌圈的边缘以肉眼不可见的细菌明显生长为限［12-13］。鼠伤寒沙门氏菌10420、产肠毒素大肠埃希氏菌10421作为质控菌株。

1.3.3据处理

数据处理采用WHONET 5软件对数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1球菌的分离与鉴定

为了便于从新疆不同种类原奶中分离获得肠球菌进行进一步研究，本实验从新疆北部各地采集牧区各类动物原奶，将原奶进行系列稀释后，选取一定稀释度的稀释液在改良的MRS培养基上进行培养分离。挑取单菌落在MRS平板上进一步划线分离，然后将划线分离后形成的单菌落进行革兰氏染色观察。油镜下观察菌体呈紫色（革兰氏阳性）、球状、单一细胞或细胞链状排列、无芽孢的菌株，将其初步认定为肠球菌，共分离获得32株菌株。进一步对其进行16S rDNA序列分析，最终确定17株菌为肠球菌，其中粪肠球菌（E.faecalis）6株，屎肠球菌（E.faecium）5株，耐久肠球菌（Enterococcusdurans）4株，希拉肠球菌（Enterococcus hirae）2株。

2.2离菌株对10种抗生素的药物敏感性

根据美国国立临床实验室标准化委员会（NCCLS）药敏纸片琼脂扩散法（K-B）法进行结果鉴定［14］，不同动物原奶中分离的17株肠球菌对10种抗生素的药物敏感性结果见表1。

通过对动物原奶中分离出的17株肠球菌的10种抗生素的耐药性的试验，由表1可知，17株肠球菌菌株对新霉素和卡那霉素表现为全部耐药，16株对链霉素耐药，1株为敏感，可见试验菌株对天然耐药的氨基糖苷类具有很强的抑制作用；17株菌对氨苄西林和头孢噻肟基本表现为敏感，其中有3株对头孢噻肟处于中介，1株表现耐药，其他都为敏感菌株，而只有一株菌对头孢噻肟表现为中介，其余都表现为敏感，这两种抗生素分别属于苯丙醇类氯霉素和青霉素类。

从试验肠球菌样品来源来看，菌株耐药情况差异性不太大，7株来源于驼奶中的肠球菌耐受4～5种抗生素的占71.4%；7株分离自马奶中的肠球菌耐受4～5种抗生素的有57.1%，牛奶样品中分离的3株肠球菌耐4种抗生素的有2株；其余一株耐3种药；而羊奶中分离的1株菌仅仅耐乳酸菌天然耐药的三种氨基糖苷类药物。综上分析，不同的样品来源，分离菌株的耐药性有所差异，驼奶中肠球菌耐药性强于马奶样品中分离的肠球菌。

表1　分离菌株对10种抗生素耐药性结果Table 1 Drug resistance results of isolated strains on 10 antibiotics

2.3敏纸片琼脂扩散法分析乳酸菌的耐药谱

根据表1结果，17株肠球菌耐药谱如表2所示。

由表2耐药谱可知，肠球菌全部耐3种及以上的抗生素，其中6株耐5种抗生素，5株耐4种抗生素，5株耐3种抗生素，1株耐2种抗生素。粪肠球菌中6株均耐3种及以上的抗生素，其中2株耐3种抗生素，3株耐4种抗生素，1株耐5种抗生素；屎肠球菌中6株均耐3种及以上的抗生素，其中1株耐3种抗生素，2株耐4种抗生素，2株耐5种抗生素；耐久肠球菌中4株耐3种及以上的抗生素，1株仅耐2种抗生素；2株希拉肠球菌均耐3种及以上的抗生素。总体来看，耐3种以上抗生素的菌株为16株占94.1%，多重耐药情况较严重，且菌株耐药情况差异性比较大。肠球菌耐受5种及以上抗生素的粪肠球菌1株占16.7%，屎肠球菌2株占40%，耐久肠球菌2株占50%，希拉肠球菌为0，可见耐久肠球菌耐药性最强，屎肠肠球菌耐药性大于粪肠肠球菌。

表2　原奶分离菌株耐药谱分型Table 2 Drug resistance typing of strains isolated from raw m ilk

2.4离菌株对10种抗生素的耐药率

综合表1和表2的结果，分离菌株对所选抗菌药的耐药率见表3。

表3　原奶分离菌株对10种抗生素的耐药率Table 3 Drug resistance rate of strains isolated from raw m ilk on 10 antibiotics

由表3可知，17株肠球菌对10种抗生素耐药率显示，实验肠球菌对新霉素和卡那霉素均为100%敏感，对链霉素耐药率较高，为94.12%，这三种抗生素均属于氨基糖苷类；对萘啶酸和四环素的耐药率分别为35.29%和23.53%；对利福平、红霉素敏感或中度敏感，耐药率分别为11.76%和17.65%，试验菌株对头孢噻肟和氨苄西林的耐药率相同，均为5.88%，敏感度较小；17株肠球菌对于苯丙醇类的氯霉素显示为全部敏感无中介。另外，有研究指出乳酸菌对氟喹诺酮类抗生素有天然耐药性，而本次的实验结果表明对萘啶酸的耐药率低于50%为35.29%。药敏结果显示，分离的17株肠球菌的多重耐药状况较为理想，其中不到50%的菌株能耐受4～5种抗生素，且包含三种目前已经明确乳酸菌天然耐药的氨基糖苷类抗生素［15］。

3　结论

近年来不断上升的肠球菌感染率与广泛使用抗生素而出现的耐药性以及广谱抗生素的筛选都有密切关系，肠球菌能够通过耐药基因的转移，来获得新型抗生素的抵抗能力［16］。本研究所检测的肠球菌均对获得性耐药，如青霉素类、头孢类、苯丙醇类和安沙霉素类抗生素表现为敏感。实验结果表明，新疆地区原奶中分离的肠球菌虽然均存在不同程度的耐药现象，且有多重耐药问题，但主要是对三种乳酸菌天然耐药的氨基糖苷类抗生素敏感，整体耐药水平相比其他商业化、产业化程度高的地区明显偏低，少数民族食用乳品受抗生素干扰影响较小，但仍需进一步对其中的肠球菌的耐药传播进行监测。

本研究分离出的原奶中的肠球菌的耐药性说明了，奶制品已经存在抗生素耐药问题。对肠球菌进行全面的药敏测试，了解各菌株的药敏谱是非常有必要的。对肠球菌的耐药性应高度警惕，避免高耐药、多重耐药菌株出现和播散，而牧草作为饲料生产的原材料，其质量也不可忽略，所以应当建立牧草中抗生素残留的检测方法并进行安全性评价，更好地保证饲料、食品的安全和人类的健康。

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Analysis of antibiotics resistancs of Enterococcus spp.form animal raw milk in Xinjiang

ZHANG Xiao，ZHOU Xingya，NIYongqing*
（College ofFood Science，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China）

17 strains of Enterococcus spp.were screened from raw m ilk of Xinjiang common animals by Kirby-Bauermethod.The drug resistance of 17 strains of Enterococcus spp.was detected with 10 antibiotics.The results of drug-resistant spectrum showed that the drug resistance rate of 17 strainson neomycin and kanamycin was100%，thedrug resistance rate on streptomycinwas94.12%.And thaton the other seven antibiotics showed different degrees of drug resistance.The drug resistance rate on nalidixic acid and tetracycline was 35.29%and 23.53%，respectively.The strains weresensitiveormoderatesensitiveon rifampicin，erythromycin，cefotaxime and ampicillin.More than 50%of thestrains could tolerate 4-5 kindsof antibiotics，which indicated that Enterococcus spp.selected from dairy products in Xinjiang ethnicm inority had drug resistance.Part Enterococcus spp.hadmultiple drug resistance.The spread of Enterococcus spp.drug resistance stillneed to be furthermonitored.

raw m ilk；Enterococcus spp；antibiotics resistance

S852．61

0254-5071（2016）01-0043-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．010

2015-11-20

国家自然科学基金地区基金项目（31360001）

张潇（1991-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术与安全。

倪永清（1969-），男，教授，博士，研究方向为食品微生物与分子生态学。