巴氏醋酸杆菌AS1.41产醋酸关键酶研究

陈　洋，高　冰，汪　超，李冬生，徐　宁，胡　勇（湖北工业大学 工业发酵湖北省协同创新中心湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068）

巴氏醋酸杆菌AS1.41产醋酸关键酶研究

陈洋，高冰，汪超，李冬生，徐宁，胡勇*
（湖北工业大学 工业发酵湖北省协同创新中心湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068）

巴氏醋酸杆菌（Acetobacerpasteurianus）将乙醇氧化成醋酸的关键酶是乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）。在不同初始乙醇含量条件下，ADH和ALDH的酶活呈现动态变化，乙醇含量为4%时，ADH和ALDH的酶活达到最大，分别为7.43U/mg和7.18 U/mg。同时，酶活与产酸速率呈现出较高一致性：酶活越高，产酸速率越快。发酵温度为32℃时，菌体生长最为活跃，酶活最大，产酸最快；加入0.5%的乙酸后，ADH和ALDH的酶活分别由8.12 U/mg和7.06U/mg提高到了9.43U/mg和8.52 U/mg，产酸速率也得到相应提升。ALDH对乙醇、乙酸、温度的稳定性均高于ADH。

巴氏醋酸杆菌；乙醇脱氢酶；乙醛脱氢酶；乙醇；温度；乙酸

醋酸菌是一类革兰氏阴性好氧菌，其中醋杆菌属（Acetobacter）、葡糖酸醋酸杆菌属（Gluconoacetobacter）、葡糖杆菌属（Gluconobacter）均可以将乙醇快速氧化为乙酸［1-2］，因此，他们广泛用于工业食醋的酿造。AS1.41是我国酿醋工业中常用的醋酸菌，该菌属于醋杆菌属中的巴氏醋酸杆菌（Acetobacterpasteurianus），具有较好的发酵性能，值得进行研究。

将乙醇氧化为乙酸是食醋生产的主要过程，这一过程主要涉及到两种较为关键的酶：乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）［3］和乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）［4］。这两种酶结合于细胞膜上，位于膜的外侧部分，吡咯喹啉醌（pyrroloquinolinequinine，PQQ）是他们的辅酶［5-6］。大量研究已经表明，醋酸发酵是依赖于PQQ-ADH和PQQ-ALDH完成的，乙醇作为底物，在PQQ-ADH的催化下生成乙醛，乙醛接着在PQQ-ALDH的作用下生产醋酸［7］。周秉辰［8］研究发现醋酸菌的产酸速率与ADH的酶活存在着明显的相关性，酶活越高产酸速率越快；TRCEK J等［9］研究发现与巴氏醋酸杆菌相比，葡糖醋杆菌能产生较高浓度的醋酸，其PQQ-ADH的活性和酸稳定性明显高于巴氏醋酸杆菌，同时PQQ-ADH的表达量也相应较多；KANCHANARACHW等［10］从酶的稳定性方面研究了醋酸菌耐高温与乙醇脱氢酶的关系，结果发现，乙醇脱氢酶氨基酸序列的差异性导致了酶的稳定性不同，而乙醇脱氢酶的稳定性与醋酸菌的耐高温特性具有一定的相关性。

醋酸菌作为酿醋的核心微生物，其在发酵过程中会面临各种压力。高浓度初始乙醇是其首先要面对的挑战。随着发酵进行，温度及乙酸逐渐对醋酸菌产生抑制作用。虽然乙醇氧化产酸与PQQ-ADH和PQQ-ALDH直接相关，但是在发酵过程中这两种酶的动态变化及稳定性与产酸之间的关系研究很少。本实验在不同的乙醇、乙酸、温度等条件下从酶活及酶的稳定性等方面，探究发酵过程中PQQ-ADH和PQQ-ALDH与醋酸菌产酸的关系，揭示这两种酶与产酸的规律。将该规律用于实际生产，通过改变乙醇、温度、乙酸等条件对酶的酶活及稳定性进行调控，达到提高醋酸产量的目的，为工业生产提供坚实的理论依据。

1　材料与方法

1.1料与试剂

1.1.1料与试剂

醋酸菌AS1.41：中国典型微生物保藏中心；葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酵母粉、铁氰化钾、无水硫酸镁、无水乙醇、体积分数40%的乙醛、Triton X-100、乙二胺二乙酸二钠盐、硫酸铁、十二烷基硫酸钠、95%磷酸等均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2养基

种子培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，灭菌冷却到50℃条件下加入体积分数为2%的乙醇；

发酵培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉15 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，灭菌冷却到50℃条件下加不同体积分数的乙醇或者乙酸。

1.2器与设备

ZHJH-C1214B紫外超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；GL-21高速冷冻离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；XO-1000D超声细胞破碎仪：上海实验仪器厂；i8双光束紫外可见分光光度计：济南海能仪器有限公司；HNY-2112B柜式全温振荡培养箱：天津欧诺仪器仪表有限公司；SY-3010发酵罐：上海世远生物设备工程有限公司。

1.3验方法

1.3.1养方法

发酵罐发酵的条件：发酵罐为10 L，搅拌的速度控制为120 r/m in，溶解氧浓度维持在22%，发酵温度根据实验要求控制。

1.3.2析方法

菌体密度：使用分光光度计在波长600 nm处测定吸光度值OD600nm。

酸度测定：0.5mol/LNaOH溶液滴定法，以醋酸计。

粗酶液的制备：参照问清江等［11］方法。

ADH、ALDH酶活的测定：参照参考文献［12］，分别取0.5m LM cllvaine缓冲液（pH 4.0），0.1m L粗酶液，0.1m L乙醇或乙醛（1.0mol/L）溶液，1%的Triton X-100溶液0.1m L加入15m L比色管中25℃保温5min；再加入0.2m L铁氰化钾溶液（0.1mol/L），25℃反应5m in（需要做空白对照）以后，加入0.5m L硫酸铁-Dupanol溶液结束反应；加3.5m L蒸馏水混合，于25℃静置20min，然后于波长660 nm处测定吸光度值。

酶活单位定义：在25℃、pH 4.0条件下，1min氧化lμmol乙醇的酶量为一个酶活力单位（U）。

酶的稳定性：为了研究ADH和ALDH在不同温度、乙醇、乙酸条件下的稳定性，用10mmol/L磷酸钾盐缓冲溶液（pH 6.0）将ADH和ALDH粗酶液的质量浓度调成1mg/m L，然后取相同体积的ADH和ALDH溶液测量其对乙醇、温度、乙酸的稳定性。乙醇稳定性：酶液中加入体积分数为0～35%的乙醇后30℃培养30m in。温度稳定性：酶液置于25～55℃培养30min。乙酸稳定性：酶液中加入体积分数为0～12%的乙酸后30℃培养30min。

相对酶活：实验组的酶活与参照组的酶活之间的比值。相对酶活的计算公式如下：

2　结果与分析

2.1醇对发酵过程中ADH和ALDH酶活的影响

发酵培养基（2 L）灭菌后分别加入体积分数为2%、4%、6%、8%的乙醇，接种8%的种子液，发酵罐中30℃发酵8 d。每天测量ADH和ALDH的酶活，醋酸的产量和醋酸菌的生物量，结果如图1和表1所示。醋酸菌的产酸包括3个阶段：高速积累期（0～3 d），平稳增长期（4～6 d），过氧化期（＞7 d）。乙醇含量的升高，醋酸菌受到的抑制作用增强。

图1　初始乙醇含量对菌株AS1．41产酸量（A）及生物量（B）的影响Fig．1 Effectof initia lethanol concentration on acid yield（A）and biomass（B）o f strain AS1．41

由图1可知，在初始乙醇含量为2%时菌株AS1.41生长最好，OD600nm值为2.22。随着乙醇含量的增加菌株AS1.41的生长周期逐渐延长。当初始乙醇含量为4%时，菌株AS1.41产酸量最大，为38.9 g/L。当初始乙醇含量达到8%时，菌株AS1.41的生长受到较强的抑制，产酸降至30.1 g/L。由表1可知，ADH和ALDH的酶活呈现动态变化。不同初始乙醇含量下，ADH和ALDH的活性均呈现出先增加后降低的趋势，在3～4 d时，ADH和ALDH的酶活均达到峰值。乙醇含量为2%～4%时，随乙醇含量的升高，ADH和ALDH的酶活也相应提高，在乙醇含量为4%时，ADH和ALDH的最大酶活分别为7.43U/mg、7.18U/mg。初始乙醇含量＞4%时，两种酶的酶活均开始下降，且ALDH下降的速度比ADH缓慢。同时，由表1还可以看出，一定量乙醇的存在对ADH和ALDH的表达有诱导作用，当乙醇含量超过这个范围（4%）时，乙醇对醋酸菌会产生毒害作用，从而严重影响ADH和ALDH的表达。

表1　不同初始乙醇含量下醋酸发酵过程中关键酶系的酶活力和产酸速率Table 1 Enzyme activity of the key enzym es and acid production rate during acetic fermentation at different initialethanol concentration

ADH和ALDH的酶活与产酸速率存在着一定的对应关系。表1体现了产酸速率与酶活的关系：酶活高时产酸速率快。发酵初期菌体要适应新环境，因而生长较弱，ADH和ALDH的表达量较少，酶活较低，此时产酸速率较小。随着菌种的生长进入对数期，ADH和ALDH的表达量增加，酶活处于较高的水平，此时，菌种产酸速率显著加快，发酵液中大量积累醋酸。随着发酵进入后期，菌种停止生长甚至死亡，酶的分泌量急剧减少，产酸速率随之下降直到停止。

在实际发酵过程中，可以通过控制发酵液中的乙醇含量调节ADH和ALDH的酶活，从而提高产酸量。对于连续补料发酵，可以控制乙醇含量为4%，此时ADH和ALDH的酶活维持在较高的水平，达到从酶学水平调控发酵，提升产量的目的。

2.2度对ADH和ALDH的影响

温度是影响醋酸发酵的重要因素。发酵培养基（2 L）灭菌后加入体积分数为4%的无水乙醇和8%的种子液，分别于28℃、30℃、32℃、35℃、37℃、39℃条件下在发酵罐（10 L）中发酵。每天测量ADH和ALDH的酶活，产酸量和醋酸菌的生长。菌种在不同温度下的生长量、产酸量及酶活结果如图2所示。

图2 温度对菌株AS1．41的生物量和产酸量（A）及ADH和ALDH的酶活（B）的影响Fig．2 Effect of tem perature on biom ass，acid yield（A）and enzyme activity of ADH and ALDH（B）of strain AS1．41

由图2A可知，醋酸菌AS1.41在不同温度下的生物量和产酸的表现是一致的，即生长越好产酸越高。在发酵温度为32℃时，AS1.41的生长最好（OD600nm=2.23），产酸量最大（39.8 g/L）。由图2B可知，ADH和ALDH的酶活与发酵温度存在相关性：发酵温度为32℃时，ADH和ALDH的酶活均达到最大，分别为8.34U/mg和7.23U/mg；随着温度继续升高（＞35℃），ADH和ALDH的酶活快速下降，且ADH的下降速率高于ALDH。

结果表明，不同温度条件下ADH和ALDH的酶活水平与菌体的生长表现是一致的，培养温度为32℃时，菌体生长最为活跃，酶活最高，产酸最快。温度过高（＞35℃）后，AS1.41的生长受到抑制，酶活降低，产酸速率下降。因此，在实际生产中，可以通过控制发酵温度，使得发酵体系中ADH和ALDH处于较高酶活水平，从而提高生产强度。从本实验的结果来看，32℃最适合作为AS1.41的发酵温度。

2.3酸（乙酸）对ADH和ALDH的影响

醋酸是醋酸菌发酵的主要产物，发酵初期醋酸的存在会对发酵产生一定的影响［13-14］，酶系水平可能也会发生一些变化。为研究底酸（乙酸）对酶的影响，发酵培养基（2 L）灭菌后加入体积分数4%的乙醇和8%的种子液，同时分别加入0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的乙酸作为底酸，在发酵罐（10 L）中32℃发酵。每天测量ADH和ALDH的酶活，产酸量和AS1.41的生长量。不同底酸下菌种的最大生长量，最大产酸量和最大酶活如图3所示。

图3　乙酸含量对菌株AS1．41的生物量和产酸量（A）及ADH和ALDH的酶活（B）的影响Fig．3 Effec t of acetic acid content on biom ass，acid yield（A）and activities of ADH and ALDH（B）of strain AS1．41

由图3A可知，菌株AS1.41的生物量随底酸的增加（0～1.5%）而缓慢减少，产酸量先增加后减少。底酸含量为0.5%时，菌株AS1.41的产酸量最大（40.8 g/L），生物量较好（OD600nm=1.98）。因此，发酵时加入0.5%的底酸对菌株AS1.41的产酸有促进作用。从图3B可知，发酵过程中，ADH和ALDH的酶活与底酸有一定关系：随底酸的增加，ADH和ALDH的酶活均先增大后降低，当底酸含量＞1.0%时，酶活快速降低，且ADH酶活的下降速率高于ALDH。

结果表明，不同底酸含量下ADH和ALDH的酶活水平与菌体的产酸表现是一致的。加入0.5%的底酸后，ADH和ALDH的酶活分别由8.12 U/mg和7.06 U/mg提高到了9.43U/mg和8.52U/mg。因此，一定量的底酸存在会形成反馈激活作用，促进ADH和ALDH的表达，从而提高其酶活。因此，在实际的生产过程中，加入一定量（0.5%）的乙酸作为底酸，可有效提高ADH和ALDH的酶活，最终达到促进发酵、提高产酸的目的。

2.4醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）的稳定性

酶在极端环境下的稳定性是工业生产上十分关心的问题［15］。因此，研究了ADH和ALDH在不同乙醇、乙酸、温度下的稳定性，结果见图4～图6。

图4　ADH和ALDH在不同乙醇含量下的稳定性Fig．4 Stability of ADH and ALDH at differentethanol concentration

由图4可知，乙醇含量＜5%时，ADH和ALDH均非常稳定，其酶活保持在较高的水平；乙醇含量为15%时，ALDH较为稳定，其剩余酶活＞82.78%，而ADH的酶活仅为初始酶活的59.32%；乙醇含量＞15%时，ADH的酶活急剧下降；当乙醇含量达到35%时，ADH几乎完全失活，而ALDH仍保留了16.54%的酶活。由此可见，ALDH对乙醇的稳定性明显高于ADH。

图5 ADH和ALDH在不同温度下的稳定性Fig．5 Stability of ADH and ALDH at different tem perature

由图5可知，ADH和ALDH的酶活在30℃时最稳定；当温度为45℃时，ADH和ALDH的剩余酶活分别为60.1%和76.3%；温度＞50℃时，ADH和ALDH的酶活迅速降低，且ADH下降速率明显高于ALDH。55℃时，ALDH保留了18.6%的酶活，而ADH失去了活性。因此，ALDH对温度的稳定性优于ADH。

由图6可知，酸的存在对ADH和ALDH的稳定性有重要的影响。随乙酸的含量从0增加到4%，ADH和ALDH的相对酶活从100%分别下降到58.5%和76.3%；乙酸含量超过6%时，ADH和ALDH的活性急剧下降，这对醋酸发酵极为不利。乙酸含量为10%时，ADH几乎失活，而ALDH的剩余酶活仅为17.1%。由此可知，ALDH对乙酸的稳定性强于ADH。

图6　ADH和ALDH在不同乙酸含量下的稳定性Fig.6 Stability of ADH and ALDH at different acetic acid content

结果表明，ALDH对乙醇、乙酸、温度的稳定性均高于ADH，因此，ADH是醋酸发酵过程中的限制酶。要保持较高的发酵效率就必须使ADH和ALDH在复杂发酵环境下仍保持较高的活性，因此，发酵条件必须进行控制：发酵的初始乙醇含量要＜10%，发酵温度≤35℃，发酵液中的乙酸含量≤4%。

3　结论

通过发酵罐进行分批发酵探究醋酸菌AS1.41产酸与关键酶系之间的关系。在不同初始乙醇浓度含量下，酶活与产酸速率呈现出较高一致性：酶活越高，产酸越快。2%～4%的初始乙醇可诱导ADH和ALDH的表达，在此范围内，ADH和ALDH的酶活明显提高。发酵温度为32℃时，菌体生长最为活跃，ADH和ALDH的酶活最大，产酸的速率最快，发酵温度＞35℃时，酶的表达受到抑制，AS1.41的产酸速率下降。在0.5%的底酸（乙酸）存在时，ADH和ALDH的酶活分别由8.12 U/mg和7.06 U/mg提升到了9.43 U/mg和8.52U/mg，产酸速率也得以提升。

通过对剩余酶活的测量来探究ADH和ALDH面对乙醇、温度、乙酸时的稳定性。与ADH相比，ALDH显示出更好的乙醇、温度以及乙酸稳定性。本研究同时表明：当乙醇含量＜10%，温度≤35℃，乙酸含量≤4%时，ADH和ALDH的酶活相对稳定，对发酵也比较有利。

酶的表达量直接关系到酶的活性大小，酶的稳定性直接关系到酶的作用时间，因此，ADH和ALDH的活性和稳定性对AS1.41产酸有直接影响。在实际发酵过程中可以通过控制发酵的初始乙醇，底酸，温度等条件达到调控酶的表达量和酶的稳定性，最终达到提升产酸量，缩短发酵周期的目的。

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Study on the key enzymes of acetic acid production from Acetobacter pasteurianus ASI.41

CHEN Yang，GAO Bing，WANG Chao，LIDongsheng，XU Ning，HU Yong*
（HubeiResearch CenterofFood Fermentation Engineeringand Technology，Research CenterofFood Fermentation Engineering and Technology ofHubei，HubeiUniversity ofTechnology，Wuhan 430068，China）

The alcohol dehydrogenase（ADH）and aldehyde dehydrogenase（ALDH）were the key enzymeswhich ethyl alcoholwasoxidized into acetic acid by Acetobacterpasteurianus.The enzyme activity of ADH and ALDH presented dynamic changesunder the conditionsof different initial ethanolcontent.When ethanolcontentwas4%，theenzymeactivity of ADH and ALDH reached themaximum 7.43U/mg and 7.18U/mg，respectively.Enzymeactivity and acid production ratepresented ahigh consistency.Thehigher the enzyme activity，the faster the acid produces.When the fermentation temperaturewas32℃，thegrow th of thestrainwas themostactive；theenzymeactivity reached to the highest，and theacid production rate was the fastest.A fter adding acetic acid 0.5%，the enzyme activity of ADH and ALDH increased from 8.12 U/mg and 7.06 U/mg to 9.43 U/mg and 8.52 U/mg，respectively.Acid production ratewasalso improved.The stability of ALDH on ethanol，acetic acid，and temperature was higher than thatof ADH.

Acetobacerpasteurianus；ADH；ALDH；ethanol；temperature；acetic acid

TS264．2

0254-5071（2016）01-0038-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．009

2015-10-28

湖北省自然科学基金（2015CFB678）；湖北省级教育部门青年人才项目（Q20151412）

陈洋（1988-），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物和发酵工程。

胡勇（1980-），男，讲师，博士研究生，研究方向为细胞工程。