超高效液相色谱串联质谱法测定啤酒中伏马毒素的含量

周贻兵，吴　坤，李　磊，林　野，刘利亚（.贵州省疾病预防控制中心，贵州 贵阳 550004；.贵州师范学院 化学与生命科学学院，贵州 贵阳 55008）

超高效液相色谱串联质谱法测定啤酒中伏马毒素的含量

周贻兵1，吴坤2，李磊1，林野1，刘利亚1*
（1.贵州省疾病预防控制中心，贵州 贵阳 550004；2.贵州师范学院 化学与生命科学学院，贵州 贵阳 550018）

该文建立了免疫亲和柱净化-超高效液相色谱串联质谱法测定啤酒中FB1、FB2和FB3的含量。与液相色谱相比较，无需衍生化，避免了化学衍生法受衍生产物的不稳定性、衍生剂的浓度、温度和反应时间等衍生效率的影响。采用多反应监测（MRM）方式进行检测，3种物质在2.5～100 ng/m L范围具有良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.999，在空白样品中加入1.0μg/kg和8.0μg/kg两个浓度水平的伏马毒素，平均回收率为88.3%～95.1%，相对标准偏差（RSD）在4.5%～8.1%，3种物质定量限均低于0.6μg/kg，精密度试验结果相对标准偏差（RSD）为0.9%～1.7%。该方法准确度高、精密度好，适用于啤酒中伏马毒素含量的测定，可为啤酒中伏马毒素的风险评估数据来源提供参考依据。

超高效液相色谱串联质谱法；伏马毒素；检测；啤酒

伏马毒素（fumonisins，FBs）是一类由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）、多育镰刀菌（Fusarium proliferatum）、轮状镰刀菌（Fusarium verticillioides）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）等产生的真菌毒素［1-2］。目前发现伏马毒素类似物有28种，分为A、B、C和P四组，以B族的FB1、FB2和FB3为主要存在形式［3］。伏马毒素是污染食品的主要成分之一，特别是FB1广泛存在于玉米及其制品中，约占伏马毒素总量的70%，伏马毒素通过污染大米、小麦、大麦、调味品、高粱、啤酒、牛奶等多种食品和饲料，对人的健康和畜牧业发展构成潜在威胁［4-7］。毒理学及流行病学调查表明，伏马毒素与马脑白质软化症（equine leukoencephalomalacia，ELEM），猪肺水肿症（pig pulmonary edema，PPE）以及人类食道癌等人畜疾病有关［8］。另外，伏马毒素还是一种慢性促癌剂，并能引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变。FBs由于分布广泛且毒性较大，因此它在食品安全检测中越来越受到人们的重视。国际上认为FBs是一种具有重大卫生学意义的真菌毒素，已形成继黄曲霉毒素之后的又一个研究热点［4］。目前国际上对于食品与饲料中伏马毒素的限量及检测方法尚无统一标准。如欧盟规定婴幼儿玉米制品中FB（含FB1和FB2）的总含量为0.2mg/kg，玉米中的限量值为4mg/kg；美国食品及药物管理局（food and drug administration，FDA）规定玉米中FB1、FB2和FB3总量的最高限量值为2mg/kg；而我国虽然制定了玉米和玉米饲料中伏马毒素的高效液相色谱检验方法，但尚无明确的限量规定［5］。酿造啤酒原料（主要是谷物、水果等）中产毒真菌在一定的条件下产生、积累形成的伏马毒素从而污染啤酒。基于食品安全的监管、控制，建立啤酒中FB1、FB2和FB3的可靠、快捷检测方法，可为促进啤酒安全提供必要的技术支撑。

伏马毒素的检测方法主要有薄层色谱法、近红外光谱法、酶联免疫吸附法［9-11］、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等［12-15］。其中薄层色谱法和近红外光谱法灵敏度和重现性较差，而酶联免疫吸附法假阳性率高，不能满足实验室定量分析要求。以气相色谱技术为基础对目标物进行检测时需要通过水解产生丙三羧酸和利用氨基衍生增强挥发度等步骤［16-17］。由于FB没有紫外吸收也不含荧光基团，用HPLC法需要柱前衍生。液相色谱-串联质谱法具有较高的选择性和灵敏度，无需水解和衍生，避免了样品基质的干扰、衍生产物的不稳定性和反应不完全等问题，因此本研究建立了免疫亲和层析柱（immnuoaffinity chromatography columns，IAC）净化-超高效液相色谱串联质谱（ultra performance liquid chrom atography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法测定啤酒中伏马毒素FB1、FB2和FB3的含量，为了解啤酒中伏马毒素污染水平提供技术方法。

1　材料与方法

1.1料与试剂

样品啤酒：购于超市；质量浓度50μg/m L伏马毒素（FB1、FB2、FB3）：Romer国际贸易（北京）有限公司；超纯水：实验室自制；甲醇、甲酸、乙酸（均为色谱纯）：天津科密欧化学试剂有限公司。

吐温-20/磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS）的配制：称取8.0 g氯化钠，0.2 g氯化钾，1.2 g磷酸氢二钠和0.2 g磷酸二氢钾溶于990m L水中，用盐酸∶水=50∶50（V/V）调节溶液的pH值至7.0，加入1.0m L吐温-20，用超纯水定容至1.0 L，混匀。

1.2器与设备

Ultimate 3000超高压液相色谱仪、TSQ Quantum ultra三重四极杆质谱仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TG16-WS台式高速离心机：Sigma中国有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹仪：北京同泰联科技发展有限公司；艾科浦Aquaplus超纯水机：上海百特科技有限公司；伏马毒素免疫亲和柱：美国维康公司。

1.3法

1.3.1品提取与净化

样品提取：称取10 g（精确至0.001 g）样品于50m L聚丙烯刻度离心管中，超声脱气15min，用吐温-20/PBS缓冲溶液稀释至40m L，混匀，稀释液待净化。

样品净化：待伏马毒素免疫亲和柱中的液体流至筛板时，将上述样品稀释液过伏马毒素免疫亲和柱，用10 m L吐温20/PBS缓冲溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，排干免疫亲和柱中的水，用3m L 2%乙酸甲醇溶液分3次洗脱免疫亲和柱，收集的洗脱液于60℃氮吹至干，加入1.0m L，甲醇∶0.1%甲酸水=10∶90（V/V）溶解残留物，涡旋混匀10 s，过0.22μm的滤膜，上机测定。

1.3.2谱条件

超高效液相色谱条件：HypersilGold-C18色谱柱（150mm× 2.1mm×1.9μm），柱温：30℃，进样体积：10μL，流动相：0.1%甲酸水溶液-甲醇，流速0.3m L/m in，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Conditions of gradient elution

质谱条件：电喷雾（electronic spray ion，ESI）离子源，喷雾电压3 200 V，毛细管温度300℃，蒸发温度240℃，鞘气270 kPa，辅助气104 kPa，碰撞气0.2 Pa，多反应监测（multiple reactionmonitoring，MRM）优化参数见表2。

表2质谱参数Table 2 The param eters ofmass spectrum

1.3.3准曲线的绘制及样品中伏马毒素的检测

用空白基质将伏马毒素标准贮备液稀释成2.5 ng/m L、5.0 ng/m L、10.0 ng/m L、20.0 ng/m L、40.0 ng/m L、60.0 ng/m L、80.0 ng/m L、100.0 ng/m L标准系列溶液，在1.3.2色谱条件下进行分析，以伏马毒素质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准工作曲线，得出标准曲线回归方程。

将样品的峰面积带入标准曲线回归方程，计算样品中伏马毒素的含量。

1.3.4密度及准确度实验

取质量浓度为10.0 ng/m L的伏马毒素混合标准溶液在1.3.2色谱条件下进行分析，连续测定6次，计算仪器精密度相对标准偏差。

在10 g空白啤酒样品中添加伏马毒素混合标准溶液，使添加水平分别为1μg/kg、8μg/kg，按照1.3.1样品提取与净化方法进行样品前处理，在1.3.2色谱条件下进行分析，每个添加水平平行测定6份，计算方法平均回收率和相对标准偏差。

2　结果与分析

2.1准曲线与定量限

按照标准曲线的制作方法，以伏马毒素质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准工作曲线，结果见图1。

图1 伏马毒素FB1（A）、FB2（B）和FB3（C）标准曲线Fig．1 Standard curve of FB1（A），FB2（B）and FB3（C）

由图1可知，FB1、FB2和FB3标准曲线的线性回归方程分别为y=4462.4x+478.6（R2=0.9998）、y=13 465.6x+3036.3（R2=0.999 4）、y=7982.2x-2 709.4（R2=0.999 1）。结果表明，二者线性关系良好。以10 S/N计算方法的定量限分别为FB1（0.3μg/kg）、FB2（0.3μg/kg）和FB3（0.6μg/kg）。

2.2标回收率实验

在空白啤酒样品中加入1μg/kg、8μg/kg的伏马毒素标准品，每个添加量做3次平行样，方法的加标回收率结果见表3。

表3　加标回收率试验结果Table 3 Results of the recovery rate tests

由表3可知，方法的平均回收率在88.3%～95.1%，相对标准偏差（relativestandard deviation，RSD）在4.5%～8.1%，结果表明该方法准确度较高。

2.3密度实验

取质量浓度为10.0 ng/m L的伏马毒素标准溶液在1.3.2色谱条件下进行分析，连续测定6次，FB1、FB2和FB3测定结果相对标准偏差（RSD）分别为0.9%、1.4%、1.7%，结果表明该方法精密度较好。

2.4UPLC-MS/MS检测样品中伏马毒素

本研究选择甲醇-含0.1%甲酸水溶液作为流动相，进行二元梯度洗脱，FB2和FB3两种同分异构体能达到基线分离（分离度为2.2），出峰顺序依次为FB1、FB3和FB2，获得标准品和样品的MRM分别见图2及图3。

图2 伏马毒素标准品的MRM图谱Fig．2 MRM chromatogram s of fumonisin standard

图3伏马毒素样品的MRM图谱Fig.3 MRM chromatogram s of fumonisin samples

随机抽取14种不同品牌的16份啤酒样品，测定其FB1、FB2和FB3的含量，其中有3份检测出伏马毒素，有1份均检出FB1、FB2和FB3，含量分别为36.5μg/kg、4.73μg/kg、1.79μg/kg；有2份检出FB1和FB2，FB1含量分别为15.5μg/kg、13.7μg/kg，FB2的含量分别为2.41μg/kg、2.24μg/kg，其余13份啤酒样品均未检出伏马毒素，但检出伏马毒素的3份样品都含有玉米原料，这可能与玉米最易受伏马毒素的污染有关。

3　结论

本研究采用了免疫亲和柱净化-超高效液相色谱串联质谱法测定啤酒中FB1、FB2和FB3含量。使用超高液相检测灵敏度比普通高效液相色谱法高，消耗的有机溶剂少，检测速度快，适用于大批量样品的监测。使用高灵敏度的质谱检测器，有效的减少基质对伏马毒素FB1、FB2和FB3测定的干扰，无需液相测方法的衍生化。该方法专属性强、线性范围宽、平均回收率为88.3%～95.1%，标准偏差为4.5%～8.1%，精密度实验结果相对标准偏差为0.9%～1.7%，该方法准确度高、精密度好，可为啤酒中伏马毒素的风险评价提供快速、灵敏、准确的分析方法。

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Determ ination of fumonisin contents in beerby UPLC-MS/MS

ZHOU Yibing1，WU Kun2，LILei1，LIN Ye1，LIU Liya1*
（1.Guizhou Provincial CenterforDiseases Controland Prevention，Guiyang 550004，China；2.SchoolofChemistry and Life Sciences，Guizhou NormalCollege，Guiyang 550018，China）

Amethod for FB1，FB2and FB3determ ination in beerwasestablished by immuneaffinity column purification-ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Compared w ith liquid chromatogram，themethod avoided the effects of derivative efficiency（including derivatives instability，derivating agent concentration，temperature，reaction time，etc.）on chem ical derivatization.By multiple reactionmonitoring mode for detection，three kindsof substanceshad a good linear relationship in 2.5-100 ng/m l range，and the correlation coefficient R2were allmore than 0.999.Adding fumonisin 1.0μg/kg and 8.0μg/kg into theblank samples，resultsshowed that theaverage recovery ratewas88.3%-95.1%，RSD was4.5%-8.1%，lim itofquantitation were allbelow 0.6μg/kg.RSD of precision experimentswas0.9%-1.7%.Themethod wasw ith high accuracy and good precision，and itwas suitable for fumonisin contents determ ination in beer，which could provide a reference basis for risk assessmentdata sourcesof fumonisin in beer.

UPLC-MS/MS；fumonisin；determ ination；beer

O657．63

0254-5071（2016）01-0152-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．034

2015-11-08

贵州省科学技术基金项目（黔科合J字［2009］2240）

周贻兵（1985-），男，副主任技师，硕士，研究方向为食品分析。

刘利亚（1978-），男，副主任技师，本科，研究方向为食品分析。