双酶法水解橡子淀粉工艺研究

郝秋娟，赵士豪*，李　娜，马同锁，李　敬，曹芳彦，孙　震

（河北经贸大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050061）

双酶法水解橡子淀粉工艺研究

郝秋娟，赵士豪*，李娜，马同锁，李敬，曹芳彦，孙震

（河北经贸大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050061）

为掌握中温α-淀粉酶和糖化酶联合水解橡子淀粉的工艺条件，该研究在单因素试验的基础上，运用正交试验设计方法对橡子中的淀粉水解工艺进行了研究和优化。结果表明，橡子淀粉最佳液化工艺条件为中温α-淀粉酶添加量30 U/g，液化温度70℃，CaCl2添加量0.3%，液化pH 7.5，液化时间120 min，葡萄糖当量（DE）值为27.79%；最佳糖化工艺条件为糖化酶添加量300 U/g，糖化温度50℃，糖化pH 4.5，糖化时间120 min，DE值为48.13%。

橡子淀粉；水解；中温α-淀粉酶；糖化酶

橡子（acorn），学名栗茧、蒙古栎，泛指除大量栽培板栗以外的壳斗科植物种子的总称［1］。橡子仁营养丰富，含淀粉、单宁、蛋白质、脂肪、多种氨基酸、维生素等［2］。韩伟等［3-9］对橡子淀粉性质及其加工特性进行了研究，发现可利用橡子仁提取淀粉，酿酒［10］、制作豆腐［11］、粉丝、保健品，也可作为饲料等。目前采用双酶法对米糠淀粉［12］、荞麦淀粉［13］、小麦芽淀粉［14］、玉米粉［15］等水解工艺研究较多，但利用双酶法对橡子淀粉水解工艺研究较少。本研究以橡子粉为原料，采用单因素试验确定了中温淀粉酶添加量、液化pH、液化温度、液化时间、CaCl2添加量以及糖化酶添加量、糖化pH、糖化温度、糖化时间，进而采用正交试验确定了橡子淀粉最佳液化工艺和最佳糖化工艺，为以橡子粉为原料采用液体发酵制备燃料乙醇提供了理论依据，为燃料乙醇的制备提供新的原料。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

橡子：采自河南信阳；中温α-淀粉酶（3 700 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司；硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、次甲基蓝、盐酸等均为分析纯：天津市永大化学试剂开发公司。

1.2仪器与设备

ISO 9001电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DGX-9143B-1电热鼓风干燥箱：上海福马实验设备有限公司。

1.3试验方法

1.3.1液化工艺条件的确定

（1）单因素试验

取一定量橡子粉按照料液比1∶5（g∶mL），100℃煮沸30 min；冷却至70℃，分别添加适量中温α-淀粉酶、CaCl2，控制适宜用pH值和液化时间，灭酶（100℃、5min），离心（3 000 r/min、15 min），取上清液测定葡萄糖当量（dextrose equivalent，DE）值，以确定最佳液化工艺条件。

（2）液化工艺优化正交试验

根据单因素试验的结果，以DE值作为考察指标，进一步设计L9（34）正交试验，以确定最佳液化工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

表1　液化工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for liquefaction technology optimization

1.3.2糖化工艺条件的确定

（1）单因素试验

分别取一定量的橡子粉液化醪液，添加适量糖化酶，控制适宜的糖化pH、糖化温度和糖化时间，测定DE值以确定最佳糖化工艺条件。

（2）糖化工艺优化正交试验

根据单因素试验的结果，以DE值作为考察指标，进一步设计L9（33）正交试验，以确定最佳糖化工艺条件。正交试验因素与水平见表2。

表2　糖化工艺优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for saccharification technology optimization

1.3.3检测分析方法［16］

干物质含量测定采用阿贝折光仪测定，还原糖含量测定采用费林试剂法。DE值计算公式如下：

2　结果与分析

2.1液化条件的确定

2.1.1中温α-淀粉酶添加量的确定

取一定量橡子粉按照料液比1∶5（g∶mL），100℃煮沸30 min；冷却至70℃，分别添加0、10 U/g、20 U/g、30 U/g、40 U/g、50 U/g中温α-淀粉酶，控制pH 7.0，加入CaCl20.3%，液化60 min，灭酶（100℃、5min），离心（3 000 r/min、15 min）取上清液测定DE值，以确定最佳中温α-淀粉酶添加量，结果如图1所示。

由图1可知，随着中温α-淀粉酶的添加量逐渐增大，DE值也逐渐增大。当中温α-淀粉酶添加量＞25 U/g时，再进一步增加中温α-淀粉酶量，DE值增加趋势变缓。在一定范围内，酶添加量越大，DE值越高，同时增加生产成本。综合考虑，选择中温α-淀粉酶的添加量为25 U/g。

图1　α-淀粉酶添加量对橡子粉液化的影响Fig.1 Effects of α-amylase addition on acorn starch liquefaction

2.1.2液化温度的确定

液化温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃，其他条件不变测定DE值，以确定最佳液化温度，结果如图2所示。

图2　液化温度对橡子淀粉液化的影响Fig.2 Effects of liquefaction temperature on acorn starch liquefaction

由图2可知，随着液化温度的升高，DE值也逐渐增大，当温度达70℃时DE值达到最大值，为16.32%。再继续增加温度，DE开始下降，说明该中温α-淀粉酶以橡子粉为底物时，其最适液化温度为70℃。

2.1.3液化时间的确定

图3　液化时间对橡子淀粉液化的影响Fig.3 Effects of liquefaction time on acorn starch liquefaction

液化时间分别为30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，其他条件不变，测定DE值，以确定最佳液化时间，结果如图3所示。

由图3可知，随着液化时间的增加，DE值也逐渐增大，当液化时间＞90 min时，DE值增长过缓，综合考虑生产成本，选择液化时间90 min。

2.1.4液化pH的确定

分别控制液化pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，其他条件不变，测定DE值，以确定最佳液化pH，结果如图4所示。

图4　pH对橡子淀粉液化的影响Fig.4 Effects of pH on acorn starch liquefaction

由图4可知，随着pH的升高，DE值也逐渐增大，但是pH 7.5时，DE值达到最大值，为20.21%。pH继续升高，DE开始下降，故选取液化pH值为7.5。

2.1.5CaCl2添加量的确定

分别添加CaCl20、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，其他条件不变，测定DE值，以确定最佳液化CaCl2添加量，结果如图5所示。

图5　CaCl2添加量对橡子淀粉液化的影响Fig.5 Effects of CaCl2addition on acorn starch liquefaction

由图5可知，随着CaCl2添加量的增加，DE值逐渐增大，当其添加量为0.2%时达到最大值，为16.32%。之后随着CaCl2添加量的增加，转化率开始呈现明显的下降趋势。这一结果与文献报道［17-19］，Ca2+对中温α-淀粉酶的稳定性有保护作用相一致。故选择CaCl2添加量为0.2%。

2.1.6液化工艺优化正交试验

根据液化阶段的单因素试验结果，进一步设计L9（34）正交试验，以确定最佳液化条件。正交试验结果与分析见表3。

表3　液化工艺优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for liquefaction technology optimization

由表3可知，在橡子淀粉液化试验中，对于DE值影响大小顺序依次B＞D＞A＞C，即液化温度＞CaCl2添加量＞中温α-淀粉酶添加量＞液化时间，最佳液化工艺条件组合为A3B2C3D3。在此最佳液化工艺条件下进行验证试验，结果表明，采用最佳工艺中温α-淀粉酶添加量30 U/g、CaCl2添加量0.3%，液化温度70℃条件下酶解120 min，测定DE值为27.79%。

2.2糖化工艺条件的确定

2.2.1糖化酶添加量的确定

分别取一定量的橡子粉液化醪液，pH 4.5，分别添加糖化酶100 U/g、200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g，60℃酶解120 min，测定DE值以确定最佳糖化酶添加量，结果如图6所示。

图6　糖化酶添加量对橡子淀粉糖化的影响Fig.6 Effects of glucoamylase addition on acorn starch saccharification

由图6可知，随着糖化酶的添加量逐渐增大，DE值也逐渐增大，当糖化酶添加量＞300 U/g时，再增加糖化酶用量，DE值增加过缓。综合考虑生产成本，选择糖化酶添加量为300 U/g。

2.2.2糖化温度的确定

其他条件不变，分别于温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下糖化，测定DE值以确定最佳糖化温度，结果如图7所示。

图7　糖化温度对橡子淀粉糖化的影响Fig.7 Effects of temperature on acorn starch saccharification

由图7可知，随着糖化温度的逐渐升高，DE值呈现先上升后下降的趋势，并且在50℃处出现最高值，为44.3%，温度高于60℃DE呈下降趋势。故选择糖化温度为50℃。

2.2.3糖化时间的确定

其他条件不变，糖化时间分别为30min、60min、90 min、120 min、150 min，测定DE值以确定最佳糖化时间，结果如图8所示。

图8　糖化时间对橡子淀粉糖化的影响Fig.8 Effects of time on acorn starch saccharification

由图8可知，随着反应时间的逐渐加长，DE值也逐渐增大，当反应时间到达90 min时，DE值增加趋势变缓，时间过长会降低生产效率，故选择糖化时间为90 min。

2.2.4糖化pH值的确定

其他条件不变，分别控制pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，测定DE值以确定最佳糖化pH，结果如图9所示。

由图9可知，随着pH逐渐增大，DE值呈现是先增后减，当pH在4.0～4.5时，DE值达最大，为45.8%，再继续增大pH，DE值呈下降趋势。综合考虑选择糖化pH 4.5。

图9　pH对橡子淀粉糖化的影响Fig.9 Effects of pH on acorn starch saccharification

2.2.5糖化工艺优化正交试验

根据糖化阶段的单因素试验的结果，进一步设计L9（33）正交试验，以确定最佳液化条件。正交试验结果与分析见表4。

表4　糖化工艺优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for saccharification technology optimization

由表4可知，在橡子粉液化醪液的糖化试验中，对DE值影响大小顺序依次是B＞A＞C，即糖化温度＞糖化酶添加量＞糖化时间，最佳糖化工艺条件组合为A2B2C3，即糖化酶添加量300 U/g，糖化温度50℃，糖化时间120 min，此时DE值为47.28%。经验证试验，最佳工艺条件下水解橡子淀粉DE值达48.13%。

3　结论

橡子淀粉最佳的水解工艺为料液比1∶5（g∶mL），100℃煮沸30 min；冷却至70℃，控制中温α-淀粉酶添加量为30 U/g，液化温度为70℃，最佳pH 7.5，液化时间为120 min，CaCl2的添加量为0.3%；控制糖化酶添加量300 U/g，糖化温度50℃，pH 4.5，糖化时间120 min。在此工艺条件下，DE值达48.13%。利用中温α-淀粉酶和糖化酶水解橡子淀粉工艺的确定，为以橡子粉为原料采用液体发酵制备燃料乙醇提供了理论依据，为燃料乙醇的制备提供了新的原料，为橡子的深加工提供了新途径。

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Hydrolysis technology for acorn starch by double enzymes

HAO Qiujuan，ZHAO Shihao*，LI Na，MA Tongsuo，LI Jing，CAO Fangyan，SUN Zhen
（College of Biological Science and Engineering，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China）

In order to perfect hydrolysis of acorn starch with the mesothermal α-amylase and glucoamylase，the hydrolysis conditions were optimized with orthogonal experiment based on single factor tests.The results showed that the optimal liquefaction process conditions were obtained as follows：mesothermal α-amylase addition 30 U/g，liquefaction temperature 70℃，pH 7.5，time 120 min，CaCl2addition 0.3%，the dextrose equivalent（DE）was 27.79%.The optimal saccharification technology conditions were obtained as follows：glucoamylase addition 300 U/g，saccharification temperature 50℃，pH 4.5，time 120 min，and DE was 48.13%.

acorn starch；hydrolysis；mesothermal α-amylase；glucoamylase

TS231

0254-5071（2016）03-0124-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.028

2016-01-08

河北省科技支撑计划项目（14236802D-2）；河北省社会科学基金项目（HB13GL036）；河北经贸大学2014年大学生创新实验项目（201400052）

郝秋娟（1976-），女，讲师，硕士，主要从事发酵工程方向的教学和研究工作。

赵士豪（1966-），男，教授，硕士，主要从事食品加工技术方向的教学和研究工作。