纤维素酶-微波辅助法提取金樱子总皂苷的工艺研究

王慧竹，陈　帅，2，朱　岩，李佳俊，钟方丽*

（1.吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022；2.沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

纤维素酶-微波辅助法提取金樱子总皂苷的工艺研究

王慧竹1，陈帅1，2，朱岩1，李佳俊1，钟方丽1*

（1.吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022；2.沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

为了研究纤维素酶-微波辅助法提取金樱子中总皂苷的工艺条件，以总皂苷提取率为考察指标，在单因素试验基础上，采用响应面分析法对试验结果进行分析，建立了金樱子总皂苷提取率与各影响因素间的回归模型。经检验，回归方程拟合度好，微波时间和酶用量对金樱子总皂苷提取率的影响显著，而酶解温度和微波功率对总皂苷提取率无显著影响，最终确定酶联微波法提取金樱子总皂苷的最佳工艺条件为：酶用量0.10 g/g，酶解温度44℃，微波时间23 min，微波功率470 W，在此工艺条件下金樱子总皂苷的提取率预测值为6.15%，实际验证值为6.11%，实际值和预测值间相对误差为-0.16%，充分验证了模型的稳定性和可靠性。

纤维素酶-微波辅助法；金樱子；总皂苷；响应面法

金樱子为蔷薇科蔷薇属植物金樱子（Rosae laevigatae）的干燥成熟果实，外观呈倒卵形，紫褐色，外面密被刺毛，10～11月果实成熟变红时采收，干燥，除去毛刺。金樱子主要生于海拔100～1 600 m的向阳的山野、田边、溪畔灌木丛中，分布于江苏、浙江、安徽、福建、江西、河南、湖北等地［1］。2015版药典一部收载本品［2］“金樱子为蔷薇科植物金樱子的干燥成熟果实，性味酸、甘、涩，平。归肾、膀胱、大肠经。具有固精缩尿，固崩止带，涩肠止泻之功能，可用于遗精滑精，遗尿尿频，崩漏带下，久泻久痢”。现代研究表明，金樱子含有多糖、有机酸、黄酮类、三萜、皂苷等多种化合物［3-8］，药理实验证实金樱子具有广泛的生理活性，如抗炎、抑菌、降血脂、降血压、调节免疫［4-6］、抗肿瘤、抗氧化［4］等作用。

由于中药化学成分多数被包裹在植物细胞壁内，一般的有机溶剂难以破坏细胞壁，提取率较低，而纤维素酶可使细胞壁疏松、破裂，从而减小传质阻力，加速有效成分的释放，进而提高提取效率、提高原料的利用价值［9］。而对于总皂苷的提取，目前最常用的方法是加热回流法，虽然提取率较高，但提取时间较长。微波提取是利用微波能来提高提取率的一种新技术，具有省时、穿透力强、选择性高、溶剂用量少等特点［10-12］，广泛应用于中药活性成分的提取。本试验采用纤维素酶-微波辅助法对金樱子总皂苷的提取工艺进行了研究，以期为金樱子资源的综合开发、利用提供一定参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

金樱子药材：吉林市吉林大药房；齐墩果酸对照品：中国药品生物制品检定所；乙醇：天津市大茂化学试剂厂；香草醛：上海谱振生物科技有限公司；冰醋酸：天津市永大化学试剂有限公司；纤维素酶（酶活力＞30 000 U/g）：上海蓝季科技发展有限公司。

1.2仪器与设备

TU-1950紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任有限公司；SHZ-D循环水真空泵：河南巩义市英峪仪器厂；RE-3000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；KQ250超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；MAS-Ⅱ微波合成萃取反应仪：上海新仪微波化学科技有限公司；FA2204B电子天平：上海精科天美科学仪器有限公司；RT-08多功能粉碎机：荣聪精密科技有限公司。

1.3方法

1.3.1对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品3.8 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，即得0.152 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液。

1.3.2供试品溶液的制备

取金樱子粉末3.0 g，按1∶10（g∶mL）的料液比加入体积分数为30%的乙醇30 mL，调节溶液pH值为6.0，准确加入纤维素酶0.1 g/g，在50℃水浴中酶解120 min，然后调节微波功率为600 W，进行微波提取2次，每次20 min，过滤，合并两次滤液，减压回收溶剂，提取液定容至50 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀即得供试品溶液。

1.3.3检测波长的确定

分别取齐墩果酸标准溶液，供试品溶液各1.0 mL置于10 mL具塞试管中，80℃水浴挥干溶剂，然后分别加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于60℃水浴中加热振荡15 min，取出后，用冰水浴冷却至室温，加入冰醋酸稀释至刻度，在波长400～600 nm之间，以2 nm为一个单位进行光谱扫描［13］。结果发现，对照品和供试品溶液在波长539 nm处均有较强吸收，故选择539 nm作为含量测定的检测波长。

1.3.4线性范围考察

精密量取齐墩果酸对照品溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL，分别置于10 mL具塞试管中，80℃水浴以挥干溶剂，加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸0.8 mL，60℃振荡水浴显色15 min后冷却10 min，各加冰醋酸稀释至刻度，摇匀，以同法平行处理的溶剂为空白［13］，在波长539 nm处测吸光度值，以质量浓度C（μg/mL）和吸光度值A建立回归方程为A=0.164C-0.1972，相关系数为0.999 1，线性范围15.2～53.2 μg/mL。

1.3.5总皂苷提取率的测定

按照齐墩果酸标准曲线回归方程，计算样品中总皂苷含量，金樱子总皂苷提取率计算公式如下：

式中：W表示总皂苷提取率，%；C表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度，mg/mL；D表示溶液稀释倍数；V表示供试品溶液体积，mL；m表示药材取样量，g。

1.3.6单因素试验

（1）酶用量对总皂苷提取率的影响

固定乙醇体积分数为30%，料液比1∶10（g∶mL），pH值为6.0，酶解温度为50℃，酶解时间为120 min，微波时间15 min，微波功率500 W，考察酶用量（0.06 g/g、0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g、0.15 g/g）对总皂苷提取率的影响。

（2）酶解温度对总皂苷提取率的影响

固定乙醇体积分数为30%，料液比1∶10（g∶mL），pH值为6.0，酶用量为0.10g/g，酶解时间120min，微波时间15min，微波功率500 W，考察酶解温度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）对总皂苷提取率的影响。

（3）微波时间对总皂苷提取率的影响

固定乙醇体积分数为30%，料液比1∶10（g∶mL），pH值为6.0，酶用量为0.10 g/g，酶解温度为50℃，酶解时间120 min，微波功率500 W，考察微波时间（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）对总皂苷提取率的影响。

（4）微波功率对总皂苷提取率的影响

固定乙醇体积分数为30%，料液比1∶10（g∶mL），酶用量为0.10 g/g，酶解温度为50℃，酶解时间为120 min，微波时间15 min，pH为6.0，考察微波功率（300 W、400 W、500 W、600 W、700 W）对总皂苷提取率的影响。

1.3.7响应面试验

在单因素试验的基础上选取酶用量、酶解温度、微波时间、微波功率4个因素为考察因素自变量，以金樱子总皂苷提取率（Y）为响应值，根据中心组合试验设计（central compositedesign，CCD）原理，设计4因素3水平响应面法优化提取工艺［14］，以-1、0、1编码分别代表自变量低、中、高水平，因素水平编码见表1。

表1　响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.8数据处理与统计分析

单因素试验结果和响应面试验结果采用SAS9.4软件进行统计分析，图表采用Origin 8.5软件进行绘制。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1酶用量对总皂苷提取率的影响

如图1所示，随着酶用量的增加，总皂苷的提取率也随之增加，但当酶用量超过0.10 g/g后，提取率并没有增加，可能是由于酶用量的增加，导致了一些非皂苷成分溶出的增加，为了进一步考察酶用量对总皂苷提取效果的影响，分别选择酶用量0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g进行响应面试验设计。

图1　酶用量对总皂苷提取率的影响Fig.1 Effect of enzyme addition on extraction rate of total saponins

2.1.2酶解温度对总皂苷提取率的影响

如图2所示，随着酶解温度的升高，提取率也相应升高，但当温度达到45℃后，总皂苷提取率最大，但当酶解温度超过45℃后，总皂苷提取率呈现出下降的趋势，可能是由于温度的升高导致酶的活力增加，从而加速总皂苷的溶出，当温度超过酶的最适温度时，酶的活力下降，甚至失活，导致总皂苷的溶出量减少。为了进一步考察酶解温度对提取效果的影响，选择酶解温度分别为40℃、45℃、50℃进行响应面试验。

图2　酶解温度对总皂苷提取率的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of total saponins

2.1.3微波时间对总皂苷提取率的影响

如图3所示，当微波时间为20 min时，总皂苷的提取率最大，之后随微波时间的延长总皂苷提取率逐渐下降，可能是因为微波时间的延长导致了非皂苷成分的溶出量增加，从而限制了总皂苷的溶出。为了进一步考察微波提取时间对金樱子总皂苷提取率的影响，选择微波时间15 min、20min、25min进行响应面试验设计。

图3　微波时间对总皂苷提取率的影响Fig.3 Effect of microwave time on extraction rate of total saponins

2.1.4微波功率对总皂苷提取率的影响

如图4所示，总皂苷提取率随着微波功率的增加而增加，但当微波功率在500～700 W时，其提取率变化不大，为了进一步考察微波提取时间对提取效果的影响，选择微波提取时间分别为500 W、600 W、700 W进行响应面试验。

图4　微波功率对总皂苷提取率的影响Fig.4 Effect of microwave power on extraction rate of total saponins

2.2响应面试验

2.2.1响应面试验设计与结果

采用中心组合试验设计，以总皂苷提取率为评价指标，进行4因素3水平响应面试验，试验结果见表2。

利用SAS 9.4软件对表2数据进行回归分析，得到以总皂苷得率（Y）为响应值，自变量为酶用量（A）、酶解温度（B）、微波时间（C）、微波功率（D）的多元二次回归方程：

对上述回归模型进行显著性检验及方差分析，结果见表3和表4。

表2　响应面试验方案与结果Table 2 Design and experimental results of response surface experiments

表3　回归系数显著性检验Table 3 Significant test of regression coefficient

表4　回归方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由表3可知，C项微波时间的系数P＜0.000 1，达到了极其显著的水平，因此微波时间对响应值的影响极其显著，A项酶用量的系数P＜0.05，达到显著水平，由此判断酶用量对总皂苷提取率影响显著，而酶解温度和微波功率对响应值影响不显著。从表3还可以看出，AB、AC、BC项系数的P＜0.01，均达到极其显著水平，故此判断酶用量与酶解温度、酶用量与微波时间、酶解温度与微波功率的交互作用对总皂苷得率的影响显著。由表4可以看出，回归方程的P＜0.0001，说明回归方程的总模型对总皂苷得率的影响均极其显著，方程的决定系数为0.965 5，说明响应值的变化有96.55%来源于所选变量，模型拟合度好，失拟项P＞0.05，说明模型中无失拟因素存在［15］。综上分析，该回归方程可以较准确地描述各自变量与响应值之间的关系。

为了更加直观表达两个因素交互作用对总皂苷得率的影响，固定两个因素的值为零水平对应的值，仅考虑另外两个因素的交互作用对总皂苷得率的影响，根据回归方程绘制响应面图和等高线图，结果如图5所示。从图5可以直观看出，各因素对总皂苷提取率的影响，曲面越陡峭，表明总皂苷提取率受该因素影响较大［16］，从等高线可以看出总皂苷提取率最佳的条件应该在圆心处。从图5A-F可以看出对总皂苷提取率影响比较大的因素为微波时间，其次为酶用量，酶解温度和微波功率对响应值影响不大；酶用量与酶解温度、酶用量与微波时间、酶解温度与微波功率的交互作用对总皂苷得率的影响显著，这与表3的分析结果相吻合。

用SAS软件对模型进行典型性分析［17］，得到金樱子总皂苷提取的最佳工艺为酶用量0.096g/g，酶解温度44.05℃，微波时间23.43 min，微波功率474.3 W，金樱子总皂苷提取率预测值为6.15%，考虑实际生产的可控性和局限性，将最佳工艺条件修正为：酶用量0.10 g/g，酶解温度44℃，微波时间23 min，微波功率470 W，在此修正工艺条件下进行验证试验，重复5次，结果如表5所示。

从表5可以看出，最佳工艺条件下，总皂苷平均提取率为6.11%，实际值与理论值的相对偏差为-0.16%，充分说明了最佳工艺条件的可靠性和稳定性。

图5　各因素交互作用对总皂苷提取率影响的响应曲面图和等高线图Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on total saponins extraction rate

表5　最佳工艺验证试验Table 5 Verification experiment results at the optimal process

3　结论

结果表明，微波时间对金樱子总皂苷的提取率的影响最显著，酶用量对总皂苷提取率的影响显著，而酶解温度和微波功率对总皂苷提取率的影响不显著，最终建立的回归方程拟合良好，能够准确反映自变量与响应值间的关系，结果显示采用酶联微波法提取金樱子总皂苷的最佳提取工艺条件为：酶用量0.10g/g，酶解温度44℃，微波时间23min，微波功率470 W，在此条件下，金樱子中总皂苷的实际提取率为6.11%。

［1］南京中医药大学.中药大辞典［M］.第二版.上海：上海科学技术出版社，2005.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.2015版（一部）.北京：中国医药科技出版社，2015.

［3］黄海婷.中药金樱子的研究现状及综合利用［J］.中国医药指南，2014，12（28）：76-77.

［4］吴玉兰，曹运长.中药金樱子的化学成分及其药理作用研究进展［J］.微量元素与健康研究，2012，29（1）：53-56.

［5］刘学贵，李佳骆，高品一，等.药食两用金樱子的研究进展［J］.食品科学，2013，34（11）：392-398.

［6］庄彦，何英姿，王彪，等.金樱子三萜类化学成分及其活性的研究进展［J］.中药材，2012，35（1）：162-164.

［7］毕葳，李强，龚卫红，等.金樱子化学成分的研究［J］.北京中医药大学学报，2008，31（2）：110-111.

［8］肖凯军，刘晓红.金樱子果实的化学成分及其应用［J］.现代食品与药品杂志，2006，16（4）：1-3.

［9］赵晓春，赵武奇，王鸿雁.纤维素酶提取小麦麸皮中总黄酮技术研究［J］.食品工业科技，2010，31（8）：265-267.

［10］郭景强.微波辅助提取技术及其在中药提取中的应用［J］.天津药学，2010，22（4）：63-65.

［11］席彩彩，张文芳，侯明月.微波提取技术在中药有效成分提取中的应用［J］.中国药业，2014，23（3）：94-96.

［12］邹涛，刘颋，黄卫东.微波法提取鲜黄姜总皂苷的工艺研究［J］.化学与生物工程，2012，10（29）：34-36.

［13］陈帅，刘克.千斤拔总皂苷的提取工艺研究［J］.吉林化工学院学报，2012，29（9）：59-61.

［14］陈帅，王慧竹，薛健飞，等.响应面法优化超声提取野葛茎中葛根素的工艺［J］.广东农业科学，2015，42（4）：60-66.

［15］刘洁，缪晓青.响应面分析法优化莲花蜂花粉多糖提取工艺研究［J］.食品科学，2010，31（14）：101-105.

［16］陈帅，王慧竹，薛健飞.响应面法优化灯心草多糖的超声提取工艺［J］.吉林化工学院学报，2014，31（1）：19-25.

［17］朱秀灵，戴清源，车振明，等.紫皮洋葱油索氏提取工艺优化［J］.食品与发酵工业，2010，36（1）：156-160.

Extraction technology of total saponins fromRosae laevigataeby cellulase pretreated-microwave assisted extraction

WANG Huizhu1，CHEN Shuai1，2，ZHU Yan1，LI Jiajun1，ZHONG Fangli1*
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China；2.School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

In order to optimize the extraction conditions of total saponins inRosae laevigataeby cellulase pretreated-microwave assisted extraction，single factor experiment was conducted with total saponin extraction rate as index，and response surface methodology was chosen to analyze the experiment results.The regression model of total saponin extraction rate with each influence factors was established.Results showed that the fitting degree of the model was good，microwave time and enzyme addition had significantly effect on extraction rate of total saponins through the regression model while the temperature of enzymatic hydrolysis had no significant effect on the extraction rate of total saponins.The optimum process conditions were as follows：enzyme addition 0.10 g/g，enzymatic hydrolysis temperature 44℃，microwave time 23 min，microwave power 470 W.Under these conditions，the predictive value for extraction rate of total saponins ofRosae laevigataewas 6.15%while the actual verification value was 6.11%.The relative error between the actual value and predictive value was-0.16%，which adequately verified the stability and reliability of the model.

cellulose pretreated-microwave assisted method；Rosae laevigatae；total saponins；response surface methodology

R931.6

0254-5071（2016）03-0084-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.019

2015-11-30

王慧竹（1981-），女，讲师，硕士，研究方向为体内药物分析。

钟方丽（1970-），女，教授，博士，研究方向为天然产物化学及应用。