高效液相色谱法测定辣椒制品中的辣椒素类物质

孙胜枚

（广东省江门市李锦记（新会）食品有限公司，广东 江门 529100）

高效液相色谱法测定辣椒制品中的辣椒素类物质

孙胜枚

（广东省江门市李锦记（新会）食品有限公司，广东 江门 529100）

该研究采用了高效液相色谱法对辣椒制品中的辣椒素类物质进行检测，并对其提取条件和检测方法进行了研究。以乙醇∶水= 70∶30（V∶V）作为提取液，采用直接萃取法提取样品中的辣椒素和二氢辣椒素，以0.3%磷酸二氢钾溶液-乙腈（62：38，V：V）为流动相，检测波长230 nm，Macherey-Nagel Nucleosil120-5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离。结果表明，辣椒素和二氢辣椒素在20～100 μg/mL质量浓度范围线性关系良好（R12=0.999 8，R22=0.999 9），检出限为0.001 g/kg，加标回收率分别为93%～104%和86%～103%，相对标准偏差RSD＜5%。该方法操作简单、快速，具有良好的准确性和精密度，可有效排除香辛料物质的杂峰干扰，适合各类辣椒制品中辣椒素类物质的检测。

高效液相色谱；辣椒素类物质；测定

日常所食用的辣椒制品中的辣味主要来源于辣椒当中的辣椒素类物质。辣椒素类物质主要包含有以下5种：辣椒素（capsaicin，CAP）、二氢辣椒素（dihydrocapsaicin，DCAP）、高辣椒素（homocapsaicin）、高二氢辣椒素（homodihydrocapsaicin）、降二氢辣椒素（nordihydrocapsaicin）［1-2］。其中辣椒类制品辣感的主要来源是辣椒素和二氢辣椒素，占辣椒素类物质总含量90%以上［3］，因此这两种辣椒素类物质也是辣味水平研究的主要对象［4-5］。

目前对于辣椒素类物质含量的检测主要方法有：比色法、薄层色谱法、紫外分光光度法和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法［6-9］。其中高效液相色谱法的应用最为广泛。国家标准GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素类物质测定及辣度表示方法》中所采用的方法也是采用高效液相色谱法。

国标方法中选取的提取液是甲醇-四氢呋喃溶液。而甲醇［10］、四氢呋喃［11］的毒性较大，对操作人员有一定的健康危害。本研究发现采作低毒的乙醇-纯水溶液同样可达到有效提取辣椒素和二氢辣椒素的效果，同时减少了对操作人员的危害，在实际应用中更为合适。

为了提高各类辣椒制品的辣椒素类物质检测方法的准确性，本研究对高效液相色谱条件进行了研究。根据样品中杂质的极性特点，调整色谱流动相极性，有效地排除香辛料对辣椒素和二氢辣椒素的杂峰干扰，使杂峰与目标峰有效分离。定量更准确，进一步优化了高效液相色谱法测定辣椒制品中的辣椒素类物质的方法。

1　材料与方法

1.1试剂与样品

辣椒油、咸红望都辣椒胚、涮涮辣辣椒干、20目辣椒粉、桂林辣椒酱、涮涮辣特辣酱、四川风味麻辣酱、麻辣酱、花椒辣油：市售。

乙醇、丙酮、磷酸二氢钾（分析纯）：广州化学试剂厂；乙腈（色谱纯）：德国Merck公司；辣椒素（纯度≥95%）、二氢辣椒素（纯度≥90%）：美国Sigma公司。

1.2仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；Macherey-NagelNucleosil120-5C18色谱柱（4.6mm×250mm，5 μm）；0.2 μm微孔滤膜过滤器（尼龙66）：天津津腾实验设备有限公司；BS224S电子天平：德国赛多利斯集团；S300H超声波清洗器：德国Elma公司；Synergy纯水机：德国Millipore公司。

1.3方法

1.3.1标准溶液的配制

分别精密称取0.050 0 g辣椒素标准品和二氢辣椒素标准品，经乙醇溶解后定容至50 mL，作为标准贮备液（辣椒素和二氢辣椒素的质量浓度分别为1 mg/mL）。以标准贮备液为基础，分别吸取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL标准贮备液至50 mL容量瓶中，并用乙醇［12-13］定容，分别配制成质量浓度为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100 μg/mL的辣椒素和二氢辣椒素标准溶液，待HPLC进样检测分析。

以质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线。辣椒素、二氢辣椒素的标准曲线线性回归方程分别为y1=10.4428x1+0.0293（R12=0.9998）、y2=8.5614x2+0.0129（R22=0.999 9），均在20～100 μg/mL质量浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系，辣椒素、二氢辣椒素的检出限为0.001 g/kg。

1.3.2样品前处理条件

（1）干椒样品/新鲜辣椒

用粉碎机把辣椒样品粉碎、研磨后，精确称取2.000 0 g干椒样品（或新鲜辣椒20.000 0 g）于100 mL的容量瓶中，用乙醇∶水=70∶30（V/V）的溶液定容，用力摇匀，室温放置2 h，并不停振荡。用0.2 μm微孔滤膜过滤，滤液收集于2 mL的样品瓶，待HPLC分析。

（2）含油脂类辣椒样品

用搅拌器将油脂类辣椒样品搅拌均匀，精确称取2.000 0 g样品于100 mL的容量瓶中，加入5 mL丙酮［14］，并摇匀，使油性物质被完全溶解在丙酮中。分3次加乙醇∶水= 70∶30（V/V）的溶液，每次加3～5 mL，并摇匀，使油性物质溶解在乙醇水溶液中，再用体积分数为70%的乙醇溶液定容，并摇匀，室温放置2 h，并不停振荡，用0.2 μm微孔滤膜过滤，滤液收集于2 mL的样品瓶，待HPLC分析。

1.3.3色谱条件

色谱条件：Macherey-Nagel Nucleosil120-5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温：30℃，流动相：0.3%磷酸二氢钾水溶液-乙腈（62∶38，V/V），流速：1.4 mL/min，检测波长：230 nm，进样量：10 μL，运行时间：45 min。

1.3.4定性定量方法

分别吸取相应浓度的标准溶液及样品提取液10 μL注入高效液相色谱仪，以1.3.3的色谱条件进行分析。用辣椒素、二氢辣椒素标准物质的保留时间定性，用外标多点校准法，以峰面积定量。

2　结果与分析

2.1色谱条件的选择

2.1.1检测波长的选择

国标方法中选择的检测波长为280 nm。在紫外光范围内，对辣椒素及二氢辣椒素标准溶液进行紫外全波长扫描光谱分析，得出230nm波长具有最大吸收波长，且230nm比280 nm的吸收峰值高且峰型平缓，且230 nm检测波长更灵敏、更稳定。因此本研究选用了230 nm作为检测波长。

2.1.2色谱流动相的选择

国标检测方法所用的流动相是甲醇∶纯水=65∶35（V/V），本研究在检测含量香辛料的辣椒制品时，根据样品中杂质的极性特点，调整色谱流动相为0.3%磷酸二氢钾溶液∶乙腈=62∶38（V/V），能有效地排除对辣椒素和二氢辣椒素的出峰干扰，使杂峰与目标峰有效分离，使定量更准确，进一步优化了高效液相色谱法测定辣椒制品中的辣椒素类物质的方法。

在此优化的色谱条件下，采用HPLC法对标准品和三种辣椒样品进行检测，标准品和三种辣椒样品的色谱图如图1所示。

图1　标准品（A）和样品（B）色谱图Fig.1 Chromatogram of the standard substance（A）and the sample（B）

由图1可知，辣椒素及二氢辣椒素标准品的出峰时间分别是16.477 min和25.414 min。样品中辣椒素和二氢辣椒素的出峰时间16.631 min和25.251 min，通过与标准的色谱图对照，样品中的待测组分与标准品的色谱图匹配性良好，对于含较多香辛料的辣椒制品（a-麻辣酱，b-花椒辣油，c-四川风味麻辣酱），杂峰与目标峰已完全分开，满足分析检测要求。

2.2烘干步骤必要性的选择

国标方法中针对新鲜辣椒或含水量＞15%的辣椒制品，必须用烘箱在50℃烘至含水量≤15%。但实际上，对于部分含水量＞15%的辣椒制品，也含有较多的油分。对于这些样品，由于油分的存在，使得样品不容易烘干，烘干时间较难把握，有的会长达7～8 h。因此，为验证烘干步骤在前处理中的必要性，本研究对含水量＞15%的辣椒制品进行50℃烘干处理，直至样品含水量≤15%。最后采用HPLC法进行检测，并与未烘干处理样品进行比较，结果见表1。

由表1可知，比较3种基质样品经烘干处理后的结果与未经烘干处理的结果，可以看出对于同一样品，是否经烘干处理，其最终的辣椒素类物质结果基本一致。样品中的水分对于辣椒素类物质检测结果基本无影响，可省去烘干这个过程，从而大大节省检测时间，提高分析效率。

表1　烘干与未烘干处理样品中辣椒素类物质含量的比较Table 1 Comparison of the content of capsaicinoids in dried and undried samples

2.3样品提取条件的选择

2.3.1提取溶剂的选择

结合辣椒素及二氢辣椒素的化学特性，针对不同的辣椒样品，进行了提取溶剂的选择试验［2-5，15］。试验选取了甲醇、乙醇、乙醇-水（70∶30，V/V）溶液和四氢呋喃-甲醇（1∶1，V/V）混合溶液4种不同的提取溶剂提取各样品中的辣椒素类物质，并进行检测，结果如表2所示。

表2　提取溶剂对辣椒素类物质提取效果的影响Table 2 Effect of extraction solvents on extraction capsaicinoids

由表2可知，4种提取液中，乙醇的提取效率最低，而其余3种提取液的提取效率比较接近。对于辣椒油、辣椒干和辣椒粉，使用乙醇-水溶液作提取液，其提取效率比四氢呋喃-甲醇的稍好。而乙醇的毒性远低于甲醇、四氢呋喃，价格也比较便宜，因此，选取乙醇∶水=70∶30（V/V）作为提取溶剂。

2.3.2提取方式的选择

在充分的粉碎和均质样品后，采用直接浸提萃取和超声萃取。直接浸提萃取：直接称样于100 mL容量瓶，用乙醇∶水=70∶30（V/V）的溶液定容至刻度，摇匀，室温放置2 h，并不停振荡摇匀。超声萃取［1-2，10］：称样于100 mL烧杯中，加入25mLV乙醇∶水=70∶30（V/V）溶液，用保鲜膜封口，在保鲜膜上用针扎几个小孔，60℃水浴超声提取30 min，把滤液收集于100 mL容量瓶，重复以上提取2次，合并提取液，用乙醇∶水=70∶30（V/V）溶液定容至刻度。采用HPLC法对两种提取方法所获得的提取液进行辣椒素类物质的检测，结果如表3所示。

表3　提取方式对辣椒素类物质提取效果的影响Table 3 Effect of extraction methods on extraction capsaicinoids

由表3可知，超声萃取方法的中间转移步骤较多，容易造成最终辣椒素类物质结果的定量损失，直接浸提萃取与超声萃取相比，萃取效果较好，且操作更为简单，可节省大量提取时间。

2.4加标回收率试验

按照上述样品前处理方法和色谱分析条件进行分析，分别取辣椒样品，添加0.049 g/kg、0.098 g/kg、0.147 g/kg三个质量浓度的辣椒素标准溶液和0.051 g/kg、0.102 g/kg、0.153g/kg的二氢辣椒素标准溶液，进行了加标回收率试验，试验结果见表4。

表4　辣椒样品中辣椒素和二氢辣椒素的加标回收率Table 4 Adding standard recovery rate of capsaicine and dihydrocapsaicin in capsicum samples

由表4可知，辣椒素和二氢辣椒素的加标回收率分别为93%～104%和86%～103%，说明该方法准确性好，能满足辣椒样品中辣椒素和二氢辣椒素的分析要求。

2.5精密度试验

取同一批四川风味麻辣酱样品共6份，按照上述测定方法对样品中辣椒素和二氢辣椒素的含量进行精密度试验。结果表明，辣椒素的含量分别为0.092g/kg、0.089g/kg、0.091 g/kg、0.093 g/kg、0.090 g/kg、0.094 g/kg，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.04%；二氢辣椒素的含量分别为0.033 g/kg、0.031 g/kg、0.032 g/kg、0.034 g/kg、0.033g/kg、0.032g/kg，RSD为3.23%。表明此方法精密度良好。

3　结论

本研究针对辣椒制品的特点，采用了高效液相色谱法对辣椒制品中的辣椒素和二氢辣椒素进行检测，并对提取条件和检测方法进行了优化。结果表明，采用毒性低、价格便宜的试剂乙醇-水（70∶30，V/V）溶液作为提取液，在样品充分粉碎均质的前提下，采用更为简便有效的直接浸提萃取的方式，大大缩短提取时间。研究表明，对于水分含量＞15%的鲜辣椒或辣椒制品，样品中的水分不会影响辣椒素和二氢辣椒素的定量检测，可省去烘干这个过程，提高了分析效率。根据样品中杂质的极性特点，调整色谱流动相极性，选用0.3%磷酸二氢钾溶液-乙腈（62∶38，V∶V）为流动相，检测波长230 nm，能有效地排除香辛料杂峰对辣椒素和二氢辣椒素的干扰，使杂峰与目标峰有效分离，使定量更准确，进一步优化了高效液相色谱法测定辣椒制品中的辣椒素类物质的方法。

辣椒素和二氢辣椒素加标回收率分别在93%～104%和86%～103%之间，精密度试验结果相对标准偏差RSD＜5%。改良后的方法更为简便、高效、准确，适合各类辣椒制品中辣椒素类物质的批量检测，值得推广。

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Determination of capsaicinoids in capsicum products by HPLC

SUN Shengmei
（Lee Kum Kee（Xin Hui）Food Co.，Ltd.，Jiangmen 529100，China）

The capsaicinoids in capsicum products was detected by HPLC，and the extraction conditions and detection method were researched.Using ethyl alcohol：water=70：30（V：V）as extracting solution，the capsaicin and dihydro capsaicin were extracted by direct extraction method，and separated by Macherey-Nagel Nucleosil120-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），using the 0.3%monopotassium phosphate solution-acetonitrile（62：38，V：V）as mobile phase and the detection wavelength of 230 nm.The results showed that the linear relationship of capsaicin and dihydro capsaicin were good in the range of 20-100 μg/ml（R=0.999 8，R=0.999 9），the limit of detection was 0.001 g/kg，and the recovery rate of capsaicin and dihydro capsaicin were 93%-104%and 86%-103%，respectively.The relative standard deviation was less than 5%.The proposed method was simple，fast，with good accuracy and precision.The method can eliminate the impurity peak interference of spices materials effectively，and it was suitable for determination of capsaicinoids in all kinds of capsicum products.

HPLC；capsaicinoids；determination

TS262.5

0254-5071（2016）03-0148-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.034

2015-12-23

孙胜枚（1964-），女，高级工程师，本科，研究方向为质量管理和法规标准。