高效液相色谱内标法测定奶粉中三聚氰胺

邸万山

（辽宁石化职业技术学院 应用化学系，辽宁 锦州 121001）

高效液相色谱内标法测定奶粉中三聚氰胺

邸万山

（辽宁石化职业技术学院 应用化学系，辽宁 锦州 121001）

以双氰胺为内标物，采用高效液相色谱内标法测定奶粉中三聚氰胺的含量，通过对色谱条件的优化，最后确立了有效的检测方法。样品经20 mL 50℃热水，0.5g无水硫酸镁，10 mL乙腈提取后，采用Nova-Pak C18色谱柱（3.9 mm×15 mm×5 μm）分离，以0.01 mol/L乙酸铵∶乙腈=90∶10（V∶V）作为流动相，218 nm为检测波长。结果表明，双氰胺在该条件下能够与三聚氰胺完全分离，可以作为测定三聚氰胺的内标物。在0.500～1.500 mg/kg的添加范围内，三聚氰胺的回收率为98.2%～100.5%。精密度实验结果相对标准偏差为0.44%。所测定奶粉样品中三聚氰胺为0.223 mg/kg。此法处理样品处理简便易行，回收率、准确度高，分析速度快，具有良好的重复性和再现性，适于测定奶粉中的三聚氰胺。

三聚氰胺；高效液相色谱法；奶粉

三聚氰胺作为一种价格低廉的有机化工原料，其最大的特点就是含氮量高（质量分数为66.6%），掺假增氮效果明显，成本低。因此，在技术上和经济上存在奶粉中掺加三聚氰胺的可能。研究表明，三聚氰胺长期累计摄入会导致肾、输尿管和膀胱结石，并有生殖系统损伤的可能性［1］。因此有必要对奶粉中的三聚氰胺进行监测，明确其实际含量，防患于未然。

奶粉中总氮质量分数测定国家标准中使用凯氏定氮法，该方法对设备要求低，操作相对简单，但精度差。国家规定奶粉中残留三聚氰胺限量＜1 mg/kg。液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的产品一律不得销售。含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的产品一律不得销售。目前，三聚氰胺的分析方法主要有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）［2-5］、气质联用法（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）［6-7］、液相色谱串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）［8-11］，大多采用外标法进行测定。外标法容易受到测定条件变化而影响测定结果。而用双氰胺作为内标物测定奶粉中三聚氰胺的测定方法报道较少。本实验以双氰胺为内标物，探索利用高效液相色谱内标法检测奶粉中的三聚氰胺含量，体现了内标法测定奶粉中的三聚氰胺含量时避免了因进样体积、检测器灵敏度、流速以及流动相组成发生变化对测定结果的影响。具有回收率高、准确度高的特点。期望为奶粉的质量评价提供依据。

1　材料与方法

1.1原料与试剂

奶粉样品：市售；双氰胺、三聚氰胺：国家标准物质研究中心；乙腈色谱纯（0.45 μm滤膜过滤，超声波脱气）：国药集团化学试剂有限公司；超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm，0.50 μm膜过滤）；乙酸铵（优级纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

810型高效液相色谱仪：美国Waters公司；KQ-700DB数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；AUW120D电子分析天平：日本岛津公司。

1.3试验方法

1.3.1色谱检测条件

色谱柱：Nova-PakC18（3.9mm×15mm×5μm）；流动相：乙腈/0.01 mol/L乙酸铵（10∶90，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：λ=218 nm；灵敏度：0.2 AUFS；柱温：30℃；进样体积：10 μL。

1.3.2溶液的配制

1.0000 mg/mL双氰胺、三聚氰胺混合标准贮备溶液的配制：准确称取双氰胺、三聚氰胺各0.100 0 g，用乙腈溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容、摇匀，0.45 μm滤膜过滤。

0.1000 mg/mL双氰胺、三聚氰胺混合标准使用溶液：准确移取双氰胺、三聚氰胺混合标准贮备溶液10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度、摇匀，0.45 μm滤膜过滤，300 W超声波脱气10 min。

1.3.3试样的处理

准确称取奶粉样品10.000 0 g于50mL具塞离心管中，加入20 mL 50℃热水，0.5 g无水硫酸镁，混匀，冷却至室温。再缓慢加入10 mL乙腈，涡旋1 min后超声提取10 min，8 000 r/min离心5 min。将离心液全部转移至100 mL容量瓶中，再向容量瓶中加入0.001 0 mg双氰胺，溶解后加入乙腈至刻度，摇匀。0.45 μm滤膜过滤，超声波脱气。处理液供液相色谱测定。

1.3.4双氰胺、三聚氰胺的定性分析

将双氰胺-三聚氰胺标准使用溶液及试样处理液10 μL在相同的色谱条件下分别注入高效液相色谱仪进行分离，以标准使用溶液色谱峰的保留时间为依据对试样处理液中的成分进行定性、定量分析。

1.3.5三聚氰胺对内标物双氰胺的相对响应值

取双氰胺-三聚氰胺混合标准使用溶液10 μL注入高效液相色谱仪进行分析，得到双氰胺-三聚氰胺的峰面积。计算三聚氰胺对双氰胺的相对响应值。

三聚氰胺对双氰胺的相对响应值Sa计算公式如下：

式中：Aa、As分别为混合标准使用溶液中三聚氰胺、双氰胺的峰面积；Wa、Ws分别为混合标准使用溶液中三聚氰胺、双氰胺的质量，mg。

1.3.6试样中三聚氰胺的定量分析

取试样处理液10 μL，注入高效液相色谱仪进行分析，得到双氰胺、三聚氰胺的峰面积，根据相对响应值计算奶粉试样中三聚氰胺的质量。计算试样中三聚氰胺含量的公式如下：

式中：W三聚氰胺表示样品中三聚氰胺的质量，g；W样双氰胺表示样品中双氰胺的质量，g；A三聚氰胺表示试样中三聚氰胺的峰面积；A样双氰胺表示试样中三聚氰胺的峰面积；W样表示样品质量，g。

2　结果与分析

2.1检测波长的选择

根据参考文献［13］，三聚氰胺、双氰胺分别在波长218 nm、210 nm处有较大紫外吸收，在此基础上，在波长200～400 nm处进行紫外光谱扫描，结果如图1所示。由图1可知，三聚氰胺、双氰胺最大吸收波长分别为226nm、215nm，2种物质在波长218 nm处都有明显吸收。因此，选择218 nm作为检测波长。

图1　双氰胺、三聚氰胺紫外吸收光谱Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of cyandiamide and melamine

2.2内标物的选择

选择双氰胺作为内标物符合以下3点的要求：一是奶粉试样中不应含有内标物双氰胺；二是双氰胺与三聚氰胺的分离度＞1.5；三是双氰胺的加入量与三聚氰胺的峰面积匹配性＞75%［14］，故双氰胺满足做内标物的要求。

2.3标准品及样品HPLC色谱图

采用高效液相色谱法对混合标准溶液及奶粉样品按照色谱工作条件的要求进行检测，所得到的色谱图见图2。

由图2可知，待测样品色谱图中出现双氰胺、三聚氰2个色谱峰与混合标准溶液色谱图中出现双氰胺、三聚氰2个色谱峰一一对应，并且分离效果良好。因此，双氰胺可以作为测定三聚氰的内标物。

图2　双氰胺和三聚氰胺混合标准液（A）和奶粉试样（B）HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of dicyandiamide and melamine mixed standard（A）and milk powder sample（B）

2.4精密度的测定

取三聚氰胺标样，平行进样5次，检测到三聚氰胺标样的相对响应值分别为1.105、1.092、1.098、1.095、1.097，平均值为1.097。计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），RSD值为0.44%。结果显示，该方法的精密度高，能满足奶粉中三聚氰胺的分析要求。

2.5加标回收率试验

在已知含量的试样中分别加入不同质量浓度的三聚氰胺标准溶液进行回收率试验，结果见表1。

表1　奶粉中三聚氰胺加标回收率结果Table 1 Standard addition recovery results of melamine in milk powder

从表1可以看出，三聚氰胺在0.500 0～1.500 0 mg/kg添加范围内，其回收率为98.2%～100.5%，表示该方法的准确度较高。

2.6奶粉样品的检测

对奶粉供试液进行检测，计算其三聚氰胺的含量，结果见表2。由表2可知，待测奶粉中三聚氰胺的含量平均值为0.223 mg/kg。国家规定奶粉中残留三聚氰胺限量＜1 mg/kg，该奶粉样品达到质量要求。

表2　奶粉中三聚氰胺的检测结果Table 2 Detection results of melamine content in milk powder

3　结论

通过以双氰胺作为测定三聚氰胺的内标物，建立了高效液相色谱内标法在测定乳制中三聚氰胺的方法。该方法在三聚氰胺0.500 0～1.500 0 mg/kg添加范围内，其回收率为98.2%～100.5%；精密度试验结果相对标准偏差RSD值为0.44%；反映了内标法避免了因进样体积、检测器灵敏度、流速以及流动相组成发生变化对测定结果的影响［15］。具有回收率高、准确度高的特点。该方法分析速度快，成本低，测定结果准确可靠，具有良好的重复性和再现性等优点，是一种很好的检测乳制中的三聚氰胺的方法，易于推广，适用于实验室日常检测工作。

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Determination of melamine in milk powder by HPLC internal standard method

DI Wanshan

（Department of Applied Chemistry，Liaoning Petrochemical Vocational and Technical College，Jinzhou 121001，China）

With dicyandiamide as internal standard，the content of melamine in milk powder was determined by HPLC internal standard method. The effective detection method was finally established by optimizing chromatographic conditions.Sample was extracted by 50℃hot water 20 ml，anhydrous magnesium sulfate 0.5 g and methyl cyanide 10 ml，separated by Nova-Pak C18chromatographic column（3.9 mm×15 mm×5 μm），with 0.01 mol/L ammonium acetate∶acetonitrile=90∶10（V∶V）as mobile phase，218 nm as detection wavelength.The results showed that the dicyandiamide was completely separated with melamine，and it can be used as the internal standard determination of melamine.Within the limits of adding 0.500-1.500 mg/kg，the recovery was 98.2%-100.5%，the relative standard deviation of precision results was 0.44%.The determination of melamine in milk powder samples was 0.223 mg/kg.The method was easy，simple，with high recovery and accuracy，fast analysis speed，with good repeatability and reproducibility.It was suitable for determination of melamine in milk powder.

melamine；HPLC；milk powder

TS207.3

0254-5071（2016）03-0145-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.033

2015-12-01

邸万山（1966-），男，副教授，本科，研究方向为工业分析、食品分析与环境分析。