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大豆酸乳发酵菌种的驯化及营养因子的研究

2016-09-16蒋予箭浙江工商大学食品与生物工程学院浙江杭州310018

中国酿造 2016年2期
关键词:酸乳酸度活菌

高 霄,陈 倩,蒋予箭(浙江工商大学 食品与生物工程学院,浙江 杭州 310018)

大豆酸乳发酵菌种的驯化及营养因子的研究

高霄,陈倩,蒋予箭*
(浙江工商大学 食品与生物工程学院,浙江 杭州 310018)

选择保加利亚杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)作为发酵菌种,通过逐步提高牛奶中豆乳的比例对菌种进行驯化的方法和改变培养基中营养成分的含量,研究大豆酸乳发酵过程中酸度值和菌落总数的变化情况。结果表明,经过驯化后的保加利亚杆菌发酵大豆酸乳过程中,酸度值从37.5°T上升至40.0°T,活菌数量提高了0.5倍;经过驯化后的嗜热链球菌发酵大豆酸乳过程中,酸度值从35.0°T上升至37.5°T,活菌数量提高了1.67倍;经过驯化后的混合菌种(保加利亚杆菌∶嗜热链球菌比例为1∶1)发酵大豆酸乳过程中,酸度值从42.5°T升至48.5°T,活菌数量提高了1.85倍;5种营养因子对大豆酸乳酸度的提高作用顺序为大豆肽>氨基酸>胡萝卜汁>低聚果糖>西红柿汁。

大豆;菌种驯化;营养因子;酸度;菌落总数

大豆作为我国的主要农作物之一,不仅产量高而且营养十分丰富,大豆进一步加工而制成的豆浆则作为中国传统饮品,一直受到国人的喜爱,豆浆中富含植物蛋白和多种维生素(如维生素B1、B2和烟酸),还含有铁、钙等矿物质。利用豆浆发酵而成的酸豆乳,其营养成分更有益于人体吸收。豆乳发酵常用的菌种是保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilic),但是由于豆乳在发酵过程中容易受到菌种及发酵机制等的影响,直接影响酸豆乳产品品质,而且豆浆中可供发酵菌种利用的营养物质也相对较少,导致发酵的大豆酸乳酸度低、活菌数量较少,严重抑制了酸豆乳发酵。本研究通过逐步提高牛奶中豆乳的比例对菌种进行驯化的方法和改变培养基中营养成分的含量(添加西红柿汁、胡萝卜汁、低聚果糖、氨基酸、大豆肽5种营养因子),使菌种在发酵过程中逐渐适应环境的变化,为大豆酸乳发酵的优化提供一定的科学依据,从而提高酸豆乳产品品质。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

豆浆:祖明豆制品有限公司提供;脱脂乳粉、西红柿、胡萝卜:市售;大豆肽粉、复合氨基酸粉(含17种氨基酸)、低聚果糖(食品级)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus),嗜热链球菌(Streptococcus thermophilic):哈尔滨美华生物技术股份有限公司。

M17固体培养基:南京森贝伽生物科技有限公司;酚酞、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠(均为分析纯)、蔗糖(食品级):郑州瑞恒化工有限公司。

1.2仪器与设备

B-HS-900/900U无菌操作台:苏州佳宝净化工程设备有限公司;ZHG-9070A(S)干燥箱:江阴滨江医疗设备有限公司;ZNCL-BS数显恒温磁力搅拌器:九阳股份有限公司;ZNCL-BS酸度计:泰州市育才教学设备有限公司;XB10200D电子天平:梅特勒-托利多集团;44X3生物显微镜:上海光学仪器一厂;SPX-250B-Z恒温培养箱:上海精密仪器仪表有限公司。

1.3实验方法

1.3.1培养基制备

MRS固体培养基的制备:精确称取葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸膏5 g、柠檬酸二铵2 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g,量取吐温80 mL、水1 L,121℃灭菌20 min。

脱脂乳培养基的制备:精确称取脱脂乳粉11 g,加100 mL蒸馏水溶解,112℃灭菌15 min。

菌种驯化培养基的制备:豆浆与脱脂牛乳分别按照0∶10、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、0∶10(V/V)的比例进行混合,再分装到50 mL锥形瓶中,112℃灭菌15 min。

1.3.2菌种的活化及复壮

菌种的活化:首先将干燥菌种进行脱脂乳活化,取1 mL脱脂乳梯度稀释后在平板上进行涂布,挑选合适梯度的单菌落进行第三代划线活化,观察菌落的形态并制备发酵剂。然后将第三代平板单菌落接种到脱脂乳中,发酵至脱脂乳发生凝固时即可,此时的发酵剂为较好的发酵剂(酸度≥40°T)。

发酵剂制作过程:菌种培养物(5 mL脱脂乳/试管)→1%~2%母发酵剂(100 mL脱脂乳/小三角瓶)。

菌种的复壮:菌种的活性在驯化和发酵过程中不断降低,在此过程中发酵性能的衰退导致乳清过多析出、酸度持续降低,而这种现象的消除需要对菌种进行复壮培养,即从发酵剂中挑取菌种进行平板涂布,37℃恒温箱中连续培养48 h,再挑取单菌落进行染色镜检,观察菌种形态是否发生变化。选择较强壮的单菌落在液体培养基上进行培养,37℃恒温箱中培养24 h,再进行平板涂布,挑取单菌落。如此重复2~3次,从液体培养基中接种适量菌液至脱脂乳培养基中,最后得到母发酵剂。

1.3.3菌种的驯化

采用增加牛乳中豆浆比例和传代驯化两种方法交叠对保加利亚杆菌和嗜热链球菌进行驯化[3]。在牛奶与豆浆体积比10∶0的环境下接种菌种进行发酵,发酵成品作为菌种再接种至牛奶与豆浆体积比9∶1的环境下进行培养。依次调整牛奶与豆浆的体积比为8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10,单菌和混合菌均按照牛奶递减的比例进行驯化。

梯度驯化过程中,每个梯度需要连续驯化2~3次,以验证菌种连续传代活性的强弱,如果菌种活性衰退,则及时进行菌种复壮。

1.3.4营养因子及大豆酸乳的制备

营养因子制备:分别称取一定质量的氨基酸粉、大豆肽粉、低聚果糖配制不同质量分数(0.5%、1.0%、2.0%、 3.0%)的溶液;西红柿、胡萝卜软化、去皮、榨汁过滤,再调配成固形物含量分别为0.5 °Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx。

大豆酸乳制备:调整豆浆中固形物含量至8%,添加蔗糖和营养因子,于90℃灭菌20 min,冷却至45℃,分别接种保加利亚杆菌、嗜热链球菌和混合菌种(保加利亚杆菌:嗜热链球菌比例为1∶1),分别于43℃发酵8 h,4℃后熟14 h,得到大豆酸乳成品。

1.3.5酸度测定及菌落计数

酸度测定按照国标GB5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》中方法进行,以滴定酸度(°T)表示。保加利亚杆菌、嗜热链球菌及混合菌种菌落计数采用国标GB 4789.35—2010《乳酸菌检验》中方法进行。

1.3.6数据处理方法

采用Excel、Origin8.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1菌种驯化对发酵过程大豆酸乳酸度的影响

图1 保加利亚杆菌(A)、嗜热链球菌(B)及混合菌种(C)发酵大豆酸乳过程中的酸度变化Fig.1 Changes of acidity in soy yogurt fermented by L.bulgaricus(A),S.thermophilus (B)and double-strains(C)

利用1.3.3法对发酵菌种进行驯化,进而测定大豆酸乳发酵过程中保加利亚杆菌、嗜热链球菌、以及驯化混合菌种(保加利亚杆菌、嗜热链球菌按照1∶1比例接种)的酸度与对照组酸豆乳(未经过驯化的菌种)的酸度。结果如图1所示。

由图1可知,在整个发酵过程中大豆酸乳酸度呈上升趋势。发酵前期酸度上升速度较快,菌种利用蔗糖并快速生长,代谢产酸使酸度上升。随着菌种数量增多,可利用的营养物质减少,环境不利于菌种的生长,因此代谢产酸速度降低,酸度的上升速度变慢。

驯化与未驯化的单菌种与混合菌种发酵对大豆酸乳的酸度影响均较大,两菌种经过驯化之后的最终酸度均增加。保加利亚杆菌经过驯化后发酵大豆酸乳的酸度从37.5°T上升至40°T。嗜热链球菌经驯化作用后发酵的大豆酸乳的酸度由35°T上升至37.5°T;经驯化后,混合菌种发酵的大豆酸乳的酸度由42.5°T升至48.5°T。

2.2菌种驯化对发酵过程大豆酸乳菌落数量的影响

利用平板涂布法对大豆酸乳在发酵过程中乳酸菌菌落数量进行计数,结果如图2所示。

由图2可知,驯化后的单菌种与混合菌种发酵对大豆酸乳的菌种数量均有较明显的增多。驯化后的嗜热链球菌发酵大豆酸乳的活菌数量提高了1.67倍;驯化后的保加利亚杆菌发酵大豆酸乳的活菌数量提高了0.5倍;驯化的混合菌种发酵大豆酸乳的菌种数量提高了1.85倍,此时发酵大豆酸乳的菌落总数为3.7×109CFU/100 mL。在发酵初期,菌种利用蔗糖进行生长代谢,驯化菌种与未驯化菌种的数量增加并且增幅相差较小。发酵后期蔗糖被消耗完,未经过驯化的菌种无法很好的适应生长环境,生长减慢,驯化菌种逐渐适应了大豆酸乳的生长环境,因此可以持续生长增殖。

2.3营养因子对大豆酸乳发酵过程中酸度及菌种数量的影响

按照保加利亚杆菌∶嗜热链球菌比例为1∶1接种,按照

1.3.4方法发酵大豆酸乳,测定发酵过程中酸度以及菌落数量的变化。

2.3.1西红柿汁、胡萝卜汁对大豆酸乳发酵过程中酸度及菌落总数的影响

西红柿汁与胡萝卜汁(固形物含量分别为0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx),于90℃灭菌15 min,在豆浆中加入4%促营养因子并接种发酵,不添加营养因子的大豆酸乳作为空白对照组。分别在发酵过程中的2~8 h测定大豆酸乳的酸度及菌落总数的变化,结果如图3、图4所示。

图2 保加利亚杆菌(A),嗜热链球菌(B)及混合菌种(C)发酵大豆酸乳过程中菌落总数的变化Fig.2 Changes of total bacterial count in soy yogurt fermented by L.bulgaricus(A),S.thermophilus (B)and double-strains(C)

图3 不同固形物含量的西红柿汁对大豆酸乳酸度(A)及菌落总数(B)的影响Fig.3 Effect of different solid content of tomato juice on the acidity(A)and total bacterial count(B)of soy yogurt

图4 不同固形物含量的胡萝卜汁对大豆酸乳酸度(A)及菌落总数(B)的影响Fig.4 Effect of different solid content of carrot juice on the acidity(A)and total bacterial count(B)of soy yogurt

由图3A及图4A可知,加入营养因子后,菌种获得了生长必需的一些营养因子,因此生长速率加快,代谢产酸能力增强。不同固形物含量的西红柿汁与胡萝卜汁对大豆酸乳的最终酸度均有提高作用。发酵后期菌种数量增多,可利用的营养物质开始减少,对照组的酸度明显低于添加营养因子的大豆酸乳的酸度,到达发酵终点时,对照组大豆酸乳的酸度为47.5°T。西红柿汁固形物含量为0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx对应的大豆酸乳的酸度分别50°T、52.5°T、53.5°T、47.5°T;胡萝卜汁固形物含量为0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx对应的大豆酸乳的酸度分别为49.5°T、53.5°T、57.5°T、51°T。固形物含量不同的营养因子对大豆酸乳的酸度有不同影响,固形物含量为2°Bx时的西红柿汁、胡萝卜汁对酸度的提高作用最大,此时大豆酸乳的酸度分别为53.5°T、57.5°T。

由图3B及图4B可知,含有不同含量固形物的营养因子对菌落总数均有不同程度的提高作用。大豆酸乳在发酵过程中,发酵2h后对照组的活菌数量为1.2×108CFU/100 mL。西红柿汁固形物含量为0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx对应的菌种数量分别为1.3×108CFU/100mL、1.9×108CFU/100mL、2.76×108CFU/100 mL、1.9×108CFU/100 mL。胡萝卜汁固形物含量为0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx对应菌种数量为2.4×108CFU/100mL、2×108CFU/100mL、7.5×108CFU/100mL、1.95×108CFU/100 mL。不断发酵过程中,菌种的生长速度逐渐下降,其中对照组的菌种生长速度下降最明显,然而添加营养因子的菌种生长速度下降较慢,甚至还有小幅增长。发酵终止后,对照组的活菌数量为3.7×109CFU/100 mL;西红柿汁、胡萝卜汁固形物含量为2°Bx,活菌数量增加最多,分别为4.3×109CFU/100 mL、5.9×109CFU/100 mL,分别为空白组活菌数量的1.2倍和1.6倍。

2.3.2氨基酸、大豆肽、低聚果糖对大豆酸乳的酸度及菌落总数的影响

分别配制不同质量分数(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%)的氨基酸、大豆肽、低聚果糖溶液,在豆浆中加入4%的营养因子溶液,接入菌种发酵,空白对照组不添加营养因子。分别在发酵过程中的2 h、3 h、4 h、6 h、7 h、8 h测定大豆酸乳的酸度变化及活菌数量,结果如图5~图7所示。

图5 不同质量浓度的氨基酸溶液对大豆酸乳酸度(A)及菌落总数(B)的影响Fig.5 Effect of different content of amino acid solution on the acidity(A)and total bacterial count(B)of soy yogurt

图6 不同质量浓度的大豆肽溶液对大豆酸乳酸度(A)及菌落总数(B)的影响Fig.6 Effect of different content of soybean peptide solution on the acidity(A)and total bacterial count(B)of soy yogurt

图7 不同质量浓度低聚果糖溶液对大豆酸乳酸度(A)及菌落总数(B)的影响Fig.7 Effect of different content of fructooligosaccharide solution on the acidity(A)and total bacterial count(B)of soy yogurt

由图5A~图7A可知,不同浓度的氨基酸、大豆肽、低聚果糖溶液对大豆酸乳发酵的酸度有提高作用。发酵结束后对照组的酸度为47.5°T,当添加氨基酸质量浓度为1.0%时,大豆酸乳酸度最高,酸度值为58.5°T;当添加大豆肽质量浓度为3.0%时,大豆酸乳酸度最高,酸度值为60°T;当添加低聚果糖质量浓度为2%时,大豆酸乳酸度最高,酸度值为55°T。

由图5B~图7B可知,3种营养因子的添加对活菌总数均有较明显的提高作用。发酵结束时对照组的活菌总数为3.7×109CFU/100 mL,当添加氨基酸质量浓度为3.0%时,大豆酸乳活菌总数为8×109CFU/100 mL,是对照组的2.16倍;当添加大豆肽质量浓度为2.0%时,大豆酸乳活菌总数为6.83×109CFU/100mL,是对照组的1.85倍;当添加低聚果糖质量浓度为2.0%时,大豆酸乳活菌总数为7×109CFU/100mL,是对照组的1.89倍。

3 结论

菌种驯化对单菌、混合菌种发酵大豆酸乳的酸度及活菌总数均有明显的增加作用。经过驯化后的保加利亚杆菌发酵大豆酸乳过程中,酸度值从37.5°T上升至40°T;经过驯化后的嗜热链球菌发酵大豆酸乳过程中,酸度值从35°T上升至37.5°T;经过驯化后的混合菌种发酵大豆酸乳过程中,酸度值从42.5°T升至48.5°T。通过添加西红柿汁、胡萝卜汁、低聚果糖、氨基酸、大豆肽这5种营养因子均有效提高了菌种的生长速度,对发酵大豆酸乳的酸度、菌种总数均有所提高,其中这5种营养因子对大豆酸乳酸度的提高作用顺序为大豆肽>氨基酸>胡萝卜汁>低聚果糖>西红柿汁。添加体积分数4.0%含量为3.0%大豆肽对大豆酸乳的酸度提高作用最为显著,酸度值由47.5°T上升至60°T,活菌总数由3.7×109CFU/100 mL增加至6.83×109CFU/100 mL。

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Study on the domestication of fermentation strains and the nutrition factors of soybean yoghurt

GAO Xiao,CHEN Qian,JIANG Yujian*
(College of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310018,China)

UsingLactobacillus bulgaricusandStreptococcus thermophilusas fermentation strains,by gradually increasing the proportion of soybean milk in cow milk to domesticate strains and changing content of nutritional components in culture medium,the changes of acidity and total bacterial count during the fermentation process of soybean yoghurt were researched.The results showed that in the soybean yoghurt fermented by domesticatedL.bulgaricus,the acidity increased from 37.5°T to 40.0°T,the viable count was increased by 0.5 times.In the soybean yoghurt fermented by domesticatedS.thermophilus,the acidity increased from 35.0°T to 40.0°T,the viable count was increased by 1.67 times.In the soybean yoghurt fermented by domesticated mixed strains(L.bulgaricusandS.thermophilusratio1∶1),the acidity increased from 42.5°T to 48.5°T,the viable count was increased by 1.85 times.The improving effect of five kinds of nutritional factors on acidity of soybean yoghurt in order was soy peptide,amino acid,carrot juice,fructooligosaccharide,tomato juice.

soybean;strains domestication;nutritional factors;acidity;total bacterial count

TS252.54

0254-5071(2016)02-0034-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.008

2015-11-27

浙江省自然科学基金资助项目(LY12C20014)

高霄(1990-),女,硕士研究生,研究方向为现代食品加工。

蒋予箭(1963-),男,教授,本科,研究方向为现代食品加工。

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