shRNA结合131I-免疫脂质体抑制胶质瘤细胞U251增殖的初步研究

张玉娜　王国玉　宋　捷　夏　伟



·基础研究·

shRNA结合131I-免疫脂质体抑制胶质瘤细胞U251增殖的初步研究

张玉娜王国玉宋捷夏伟

目的探索RNA干扰与131I-免疫脂质体联用在胶质瘤疾病治疗中的潜在价值。方法在合成pGPU6-GFP-Neo-EGFRvIII-shRNA表达载体的基础上，结合核素内放射性131I免疫脂质体，进行细胞实验探索其对胶质瘤细胞U251增殖凋亡的影响。结果成功构建pGPU6-GFP-Neo-EGFRvIII-shRNA载体；同时细胞实验结果显示，shRNA和131I免疫脂质体联用有效抑制胶质瘤细胞U251增殖和促进其凋亡，抑制率达70%。结论shRNA结合131I免疫脂质体能高效地促凋亡和抑制细胞增殖，为其在胶质瘤治疗中的应用奠定了初步基础。

神经胶质瘤;U251细胞;131I;shRNA;RNA干扰;免疫脂质体

(The Practical Journal of Cancer,2016,31:1219～1221)

脑胶质瘤属于中枢神经系统的恶性肿瘤，是最常见的和最具侵袭性的原发性脑瘤[1]，约占全部颅内肿瘤的45%左右[2],，恶性胶质瘤疗效差，预后差[3-4]。随着RNAi技术的不断发展，以RNA为基础用于治疗多种人类疾病包括癌症的潜在而安全有效的基因治疗方法应运而生[4]。国内外已有关于免疫脂质体作为载体运送shRNA的报道，新近研究证实，免疫脂质体还可以通过血脑屏障[4-5]。同时，放射性核素131I作为一种经典的核素示踪剂，除在影像诊断领域发挥重要作用外，也早已逐步应用于诊断与治疗并重的分子功能显像和分子靶向治疗领域[6]。目前已知EGFR的过表达能够促进细胞生长、增殖、迁移，在肿瘤发生过程中起重要作用[7]。其突变体EGFRvⅢ与野生型EGFR相比缺失6-273位氨基酸残基，这种突变体只出现在肿瘤细胞中，是一个很好的肿瘤治疗靶标[8]。本研究针对EGFRvⅢ基因，构建特异性shRNA表达载体，由免疫脂质体导入胶质瘤细胞系U251细胞表达，评估其对U251细胞政治凋亡的影响，以期为恶性胶质瘤的治疗提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料

U251细胞株由中国科学院上海生科院细胞资源中心提供；高糖DMEM购自GIBCO；新生牛血清购自Life Technologies；免疫脂质体购自INVITROGEN；pGPU6-GFP-Neo载体购自吉玛；Trizol购自INVITROGEN；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)购自TaKaRa；RIPA裂解液(强)、BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪；Anti-EGFR (phospho Y1173) antibody [E124]，Goat Anti-Rabbit IgG Fc购自Abcam；MTT细胞增殖及Annexin V-PI细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天。

1.2方法

1.2.1shRNA表达载体的构建依据pGPU6-GFP-Neo载体的克隆要求将EGFRvⅢ胞外区基因序列的shRNA序列5'-GAAAGGUAAUUAUGUGGUG-3'[9]克隆到pGPU6-GFP-Neo载体，同时将NC序列 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'克隆到pGPU6-GFP-Neo载体作为阴性对照。

1.2.2131I标记免疫脂质体使用Bolton和Hunter方法，Bolton Hunter试剂溶于DMSO，浓度为22.5 μCi/μL。60 μL的聚合物溶液与20 μL的Bolton Hunter在室温下反应60 min。从低分子量产品中进行纯化，并更换缓冲液为含有150 mM NaCl，pH为7.4的Hepes 缓冲液。每0.8 mL的馏分被收集，确定放射性活度和样品收集。

1.2.3体外细胞实验取U251细胞接种96孔板，5.0×103个/孔，设多个平行孔，细胞分不同治疗组：131I组、131I-免疫脂质体组、shRNA-131I-免疫脂质体组、shRNA-免疫脂质体组、空白对照组，与U251细胞孵化48 h。

1.2.4MTT分析MTT法测定肿瘤细胞生长抑制率(GIR)，分析基因治疗和内照射治疗的协调效应。

1.2.5转录水平检测Real time PCR方法检测靶基因的敲降效果，提取出总RNA，逆转录合成cDNA，然后进行PCR反应。PCR引物如下：EGFRvⅢ(F:TGACTCCGTCCAGTATTGATCG，R:ATTCCGTTACACACTTTGCGGC);EGFRvⅢ-shRNA(F:GAAAGGTAATTATGTGGTG，R:TTGATGAGTTTGGACAAACC);EGFRvⅢ-NC(F:TTCTCCGAACGTGTCACGT，R:TTGATGAGTTTGGACAAACC);GAPDH(F:TTGAAGGGTGGAGCCAAAC，R:ACAGTCTTCTGGGTGGCAG).

1.2.6蛋白质水平检测Western Blot方法分析靶基因蛋白表达水平的变化，提取各组细胞总蛋白，测定含量后进行SDS-PAGE胶电泳并转膜，进行化学发光反应，显影、定影，用凝胶图象处理系统分析目标带。

1.3统计分析

数据处理应用SPSS 10.0 软件，应用T-student检验分析组间差异，P<0.05被认为具有显著性差异。

2　结果

2.1shRNA表达载体构建

根据EGFRvⅢ基因的CDS序列设计shRNA序列，合成后通过限制性内切酶BamH Ⅰ和BbsⅠ将其克隆至pGPU6-GFP-Neo载体，并且测序验证克隆成功，见表1。

表1　shRNA载体克隆序列信息表

2.2EGFRvⅢ转录水平分析

为了分析不同处理条件下细胞转录水平EGFRvⅢ mRNA变化情况，取48 h后所得细胞抽提总RNA，并逆转录为cDNA，进行Real time PCR反应，结果如图1A所示，与空白对照组相比，在转录水平上，shRNA-131I-免疫脂质体组EGFRvⅢ mRNA含量最低，shRNA-免疫脂质体组其次，131I组、131I-免疫脂质体组与空白对照组之间无显著性差异。

2.3EGFRvⅢ蛋白水平分析

取48 h后所得细胞进行总蛋白抽提，并经蛋白定量后进行Western blot实验，分析不同处理条件下细胞蛋白水平EGFRvⅢ变化情况，结果如图1B所示，在蛋白表达水平上，131I组、131I-免疫脂质体组EGFRvⅢ蛋白含量与空白对照组无显著性差异，shRNA-免疫脂质体组EGFRvⅢ蛋白含量下降，shRNA-131I-免疫脂质体组EGFRvⅢ蛋白含量显著降低。

2.4细胞增殖分析

为了分析"shRNA-免疫脂质体-131I"复合物对U251细胞增殖凋亡的影响，复合物处理细胞48 h后，首先通过MTT法分析各组细胞增殖情况，结果如图2所示，与空白对照组相比，其他各组细胞增殖都有明显下降，尤其是shRNA-免疫脂质体-131I组。结果提示RNA干扰结合131I-免疫脂质体能更有效地抑制胶质瘤细胞U251增殖。

A为Real time PCR，B为Western blot。

图2　MTT法检测细胞活力变化

3　讨论

随着分子生物学的发展，RNAi技术取得了迅猛发展，已被广泛用于探索基因功能和多种疾病及恶性肿瘤的基因治疗[10-11]。Fan等[9]利用特异针对EGFRvⅢ的外显子1和外显子8结合序列的siRNA，有效地抑制EGFRvⅢ在人胶质瘤细胞的表达，导致磷酸化丝苏氨酸激酶水平下降，从而增加细胞的凋亡。Pirollo等[12]采用脂质体包裹小型干扰RNA(Short interfering RNA，siRNA)治疗肿瘤，发现其可明显降低肿瘤转移率。Mizuno 等[13]分别将免疫球蛋白G(IgG)和G-22单抗的F(ab)2和阳离子脂质体偶联制成免疫脂质体，研究通过这2种免疫脂质体将LacZ基因转染到不同的神经胶质瘤细胞系中的效果。与未偶联抗体的普通脂质体相比，在表达cd44抗原的细胞中，β-半乳糖苷酶活性增加约2倍 ；与单次使用免疫脂质体相比，重复使用则使β-半乳糖苷酶活性又增加约2倍。结果显示，重复使用阳离子免疫脂质体能获得较高的基因转染效果，是基因治疗神经胶质瘤的潜在有效方法。与此同时，131I发出β粒子，由于其电离作用较强，对肿瘤组织可产生较强的抑制和破坏作用，射程较短，对肿瘤外正常组织影响较小，且具有可示踪性等特点，一直被认为是近距离内照射治疗肿瘤的理想选择。

本研究旨在整合RNA干扰、免疫脂质体和放疗，探索治疗胶质瘤的高效方法。首先，通过基因克隆手段成功构建pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢshRNA载体；同时转染结果显示其能在转录水平和蛋白水平高效沉默EGFRvⅢ基因；最后，将其结合131I-免疫脂质体处理胶质瘤细胞U251，分析其对细胞增殖凋亡的综合效果，结果显示三者联用更有效地抑制细胞的增殖，并促进细胞的凋亡。但是上述都是体外实验的结果，并不代表其在体内仍然能抑制癌细胞生长和促进细胞凋亡。所以，我们的下一步将进行动物体内实验，探索三者在动物体内的抑癌作用。

综上所述，本研究成功构建pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢshRNA载体，并在细胞水平证明pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢshRNA-131I-免疫脂质体能更高效抑制胶质瘤细胞增殖，该结果为其在肿瘤治疗中的应用奠定了初步基础。

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[13]Mizuno M,Yoshida J.Repeated exposure to cationicim munoliposomes activates effective gene transfer to human glioma cells〔J〕.Neural Med H,1996,36 (3):141.

(编辑：吴小红)

A Preliminary Study about the Inhibition of U251 Cell Proliferation by Expressing shRNA Combined with131I-immune Liposome

ZHANG Yu'na,WANG Guoyu,SONG Jie,et al.

Putuo District People's Hospital,Shanghai,200060

ObjectiveTo investigate the potential value of RNAi combined with131I-immune liposome in glioma treatment.MethodsStructuring the vector harboring EGFRvⅢ shRNA expression cassettes,used in cell experiments with131I-immune liposome,to study the effect on proliferation and apoptosis of U251 cells.ResultsshRNA combined with131I-immune liposome targeted to EGFRvⅢ was able to effectively inhibit the proliferation and apoptosis of U251 cell.The inhibition rate was 70%.ConclusionshRNA combined with131I-immune liposome can efficiently promote apoptosis and inhibit cells proliferation,which laid a preliminary foundation for its application in the treatment of gliomas.

Gliomas;U251 cell;131I;shRNA;RNA interference;Lmmune liposome

上海市卫生与计划生育委员会青年基金项目(编号：20114y194)

200060 上海市普陀区人民医院(张玉娜，王国玉，宋捷)；200137 上海市第七人民医院(夏伟)

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.08.001

R730.264

A

1001-5930(2016)08-1219-03

2015-09-19

2016-07-071)