两种用药方式对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

兰艳丽　刘　韵



两种用药方式对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

兰艳丽刘韵

目的比较去甲斑蝥素(noreantharidin,NCTD)单独用药和联合ABT-737 2种用药方式对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响。方法应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法，检测NCTD单药或联合ABT-737 2种用药方式对宫颈癌细胞株HeLa和SiHa 增殖的影响；应用流式细胞术分析NCTD联合ABT-737对宫颈癌细胞凋亡的影响。结果NCTD单独用药能够显著抑制宫颈癌细胞株HeLa和SiHa的增殖(P<0.05)，且抑制作用呈剂量依赖性，而且NCTD与ABT-737联用后对宫颈癌细胞增殖的抑制作用明显增强。NCTD和ABT-737联合用药的促凋亡作用比单独用药效果显著增强(P<0.05)。结论体外单独使用NCTD对宫颈癌细胞HeLa和SiHa的增殖具有明显抑制作用，联合使用ABT-737后对其增殖抑制以及促凋亡作用更明显。

宫颈肿瘤； 癌； 斑蝥素； 细胞增殖； 细胞凋亡

(The Practical Journal of Cancer,2016,31:1230～1233)

宫颈癌常见的女性恶性肿瘤，发病率仅仅低于乳腺癌，是对女性造成危害的第二大疾病。细胞周期失调是细胞过度增殖而致使癌变产生的重要原因[1]。化疗是治疗宫颈癌的有效方法。目前多数宫颈癌化疗药物以降低患者的免疫系统抵抗力为代价发挥其抗癌作用，对患者的预后产生极大影响。积极寻找更为有效的且安全的化疗药物是我们的焦点。

去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是1种我国率先对我国传统中药斑螫改良合成的新型抗肿瘤药物，对肿瘤的恶性生长如侵袭、转移具有抑制作用，同时还具有抑制肿瘤增殖、诱导其凋亡的作用，对多种肿瘤具有治疗作用，如乳腺癌、肺癌等[2]。此外，NCTD独特的抗癌优势为能升高机体白细胞水平，从而成为抗癌研究的热点。NCTD因其较强的毒副作用、多次重复给药等缺点仅仅作为临床上抗癌治疗的辅助药物[3-4]。BCL-2抑制剂ABT-737有较少毒副作用和良好抗癌活性[5-6]，本研究就ABT-737的优势联合NCTD做更深入探讨，以期寻找对宫颈癌治疗的高效且安全的方案。

1　材料与方法

1.1实验用品

宫颈癌细胞系HeLa和SiHa(上海复旦大学)。NCTD(郑州大学)，ABT-737(上海前尘生物科技有限公司)；Annexin V/PI凋亡试剂盒(上海前尘生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养将HeLa和SiHa细胞接种在10 cm培养皿中，尽可能使细胞分布均匀，培养基采用DMEM高糖培养液(含10%胎牛血清)，在5%CO2、37 ℃恒温孵育箱中培养。对所培养的细胞每日用倒置显微镜观察生长状态，并做记录，24 h后细胞贴壁对其培养基进行更换，并且按照各种细胞的增长速度选择1～2天更换一次培养基。

1.2.2细胞增殖的检测采用MTT法通过检测细胞能量代谢来反映宫颈癌细胞增殖活力。96孔板中接种HeLa和SiHa细胞，密度1×105/孔。调零组[即空白组，添加同体积DMEM，药物和细胞缺如，去除96孔板和培养基对OD值的影响]、对照组(药物缺如)和加药组(设置NCTD的浓度梯度为7.5，15，30，60，120，240，480 μmol/L)，每个组设3个复孔。在细胞贴壁后加药进行作用48 h，随后加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，然后终止培养，小心的弃去培养孔内上清液，添加DMSO 150 μl/孔，置入温箱中10 min后，使得结晶物充分融解，调节酶联免疫检测仪于490 nm波长处，测定各孔光吸收值并记录实验结果。重复3次独立实验。分析各组细胞存活率。存活率=(加药组平均OD值-调零组平均OD值) /(对照组平均OD值-调零组平均OD值)×100%。

1.2.3宫颈癌细胞增殖的检测96孔板中接种HeLa和SiHa细胞，密度1×105/孔。分组为调零组和对照组以及ABT-737与NCTD联合组。联合组中NCTD的浓度梯度方别为0、30、60、120、240 μmol/L，ABT的浓度梯度为0.25、0.5、1、2 μmol /L，前一药物中各浓度与后一药物中各浓度两两混合。独立实验重复3次[5]。

1.2.4宫颈癌细胞凋亡的检测把HeLa和SiHa 细胞接种在培养皿中，分为药物联合组、对照组、NCTD组和ABT-737组。于细胞对数期加入药物(ABT-737=1 μmol/L，NCTD=60 μmol /L)，药物作用48 h后，各培养皿中加入胰酶37 ℃下消化3～5 min，然后将混合液移至15 mL离心管1 000 rpm离心5 min，弃上清液。对细胞进行冲洗，悬于PBS缓冲液中。凋亡检测步骤按试剂盒说明书进行，细胞凋亡应用流式细胞仪进行检测。

1.3统计学方法

应用SPSS 17.0 软件进行数据分析，采用方差分析和单因素方差分析。

2　结果

2.1NCTD对细胞增殖的抑制作用

采用MTT检测，NCTD的浓度为60 μmol/L时(HeLa细胞)和NCTD的浓度为30 μmol/L时(SiHa细胞)对细胞增殖有抑制作用(P<0.05)，且NCTD的浓度为120 μmol/L时(HeLa细胞)抑制作用明显(P<0.001)，且随药物浓度的增加，NCTD对细胞增殖的抑制作用增强(P<0.001)。所以NCTD对HeLa 和SiHa 细胞的增殖抑制作用与药物剂量呈正相关性，见表1。

表1　MTT法检测NCTD对细胞增殖的影响

注：与对照组比较，*为P<0.05；**为P<0.001。

2.2NCTD联合ABT-737对细胞增殖的抑制作用

经过MTT检测，在HeLa细胞和SiHa细胞中，NCTD和ABT-737单独应用产生的抑制作用与药物浓度呈正相关(P=0.000)，但是此相关性在HeLa细胞中不存在协同作用(P=0.093)；而在SiHa细胞中NCTD与ABT-737之间存在协同作用(P=0.000)，见表2、表3。

表2　MTT法检测两种药物联合作用对HeLa细胞存活率的影响±s，%)

表3　MTT法检测两种药物联合作用对SiHa细胞存活率的影响±s，%)

2.3FCM检测NCTD联合ABT-737对宫颈癌细胞的作用

经过FCM检测，在两种宫颈癌细胞(Hela、SiHa)中，ABT-737组、NCTD组与对照组对比，ABT-737组、NCTD组的细胞凋亡率升高 (P<0.05)；与ABT-737单药组以及NCTD单药组相比，两药联合组细胞凋亡率升高(P<0.05)；不同的是在Hela细胞中NCTD与ABT0-737并不存在协同作用(P=0.980)；在SiHa 细胞中NCTD与ABT-737存在协同作用(P=0.000)，见表4。

表4　各组HeLa、SiHa细胞凋亡情况，%)

3　讨论

宫颈癌是1种较容易早发现、早确诊的妇科常见恶性肿瘤，尤其科学的发展使得宫颈细胞学筛查得以普遍应用，更是提高了其早期诊断率，即便如此宫颈癌的病死率仍呈逐年上升的趋势，且趋向于年轻化。在宫颈癌治疗中，化疗是放疗无效和治疗手术失败患者的1种重要且有效的手段，但其治疗效果始终偏低，在临床上有30%～40%的患者化疗失败[6]。目前宫颈癌的治疗主要为手术加化疗，但化疗所致骨髓抑制以及白细胞降低等毒副作用对患者免疫系统造成极大伤害，降低患者的抵抗力，从而限制其治疗效果，因而探寻一种安全有效化疗药物是宫颈癌化疗药物研究所关注的焦点，这也是本研究要探究的问题。

近年关于NCTD对癌细胞凋亡机制的研究已经取得了一些成果。Li等[7]研究结果显示NCTD能够诱导肝癌细胞凋亡，且细胞凋亡率与剂量呈正相关关系，但是与此同时线粒体膜电位则刚好与之相反，Cytochrome-C和Bax的表达量明显升高，而Bcl-2表达量下降，肝癌细胞内的AI及Casepase-3被活化，表明NCTD通过线粒体信号转导途径对癌细胞的发挥诱导凋亡作用。有文献报道，活性氧簇(aos)的升高以及线粒体信号转导途径可能是NCTD诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的原因[8]。Yeh等[9]研究表明NCTD通过TRAILDR5信号途径实现对人肝癌细胞Hep3B凋亡的诱导，而TRAILDR5信号途径则具有抑癌基因P53基因依赖性。An等[10]研究结果表明，NCTD呈剂量与时间依赖性抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。该研究还发现，线粒体、Caspase、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径可能参与NCTD对宫颈癌细胞的促凋亡作用，具体作用机制还不十分明确。本实验结果表明宫颈癌HeLa、SiHa 细胞中，NCTD对其增殖抑制作用明显，且存在剂量依赖性。但因NCTD 半衰期短需重复注射，且经肾脏排泄易致泌尿系统毒性而限制其单独用药的治疗效果。

Zhang等[11]研究结果表明，肝癌细胞中，NCTD联合ABT-737对增殖的抑制作用明显，对其凋亡存在促进作用，该作用是通过线粒体信号转导途径实现的。本研究结果表明NCTD对宫颈癌细胞的增殖，联合ABT-737后用药后抑制作用明显增强。两药联合使用时，通过升高ABT-737的浓度而降低NCTD的用药剂量，可以降低药物的不良反应，即NCTD的抑制增殖作用可以通过ABT-737明显增强。流式细胞术检测结果显示，NCTD联合ABT-737可以显著促进宫颈癌细胞凋亡(P<0.05)，且比单独用药作用的效果更加显著(P<0.05)。NCTD联合ABT-737后对凋亡的促进作用可能是通过其增强线粒体细胞凋亡途径的结果，NCTD联合ABT-737用药对宫颈癌细胞的增殖抑制和凋亡促进的作用机制还需进一步研究，这也为我们以后的研究思路提供了广阔的空间和方向。

综上所述，两种用药方式，NCTD联合ABT-737用药对宫颈癌增殖的抑制作用和凋亡促进作用较NCTD单独用药更加显著增强，且ABT-737可以明显减少NCTD对于患者免疫系统的伤害。

[1]喻小兰，卢科莲，夏纪毅，等.黄芩素干预宫颈癌细胞凋亡机制的研究〔J〕.现代预防医学，2015,42(1)：121-124,130.

[2]潘春英，顾新刚.去甲斑蝥素抗肝癌作用机制的研究进展〔J〕.现代肿瘤医学，2015,23(4)：575-577.

[3]Deng L,Tang S.Norcantharidin analogues：a patent review(2006-2010)〔J〕.Expea Opin Ther Pat，2011，21(11)：1743-1753.

[4]Zhao Q,Qian Y,Li R,et al.Norcantharidin facilitates LPS-mediated immune responses by up- regulation of AKT/ NF- kβsignaling in macrophages〔J〕.PLoS One，2012，7(9)：e 44956.

[5]李泽明，余进进，陆冰颖.丙戊酸钠联合紫杉醇对宫颈癌Hela细胞抑制作用的研究〔J〕.实用癌症杂志，2013,28(2)：121-124.

[6]张慧君.奈达铂或伊立替康联合紫杉醇作为首选方案治疗中晚期宫颈癌的疗效比较〔J〕.实用癌症杂志，2013,28(3)：272-274.

[7]Li XQ,Shao SH,Fu GL,et al.Study on norcantharidin-induced apoptosis in SMMC-7721 cells through mitochondrial pathways〔J〕.Chin J Integr Med，2010，16(5)：448-452.

[8]Chang C,Zhu YQ,Mei JJ,et al.Involvement of mitochondrial pathway in NCTD-induced eytotoxicity in human hepG2 cells〔J〕.J Exp Clin Cancer Res，2010，29：145.

[9]Yeh CB,Hsieh MJ,Hsieh YH,et al.Antimetastatic effects of norcantharidin on hepatocellular carcinoma by transcriptional inhibition of MMP-9 through modulation of NF-Kβactivity〔J〕.PLoS One，2012，7(2)：e31055.

[10]An WW,Gong XF,Wang MW,et al.Norcantharidin induces apoptosis in HeLa cells through easpase，MAPK，and mitochondrial pathways〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2004，25(11)：1502-1508.

[11]Zhang S,Li G,Ma X,et al.Norcantharidin enhances ABT-737 induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells by transcriptional repression of Mcl-1〔J〕.Cell Signal，2012，24(9):1803-1809.

(编辑：吴小红)

Influence of Two Kinds of Treatments on the Proliferation and Apoptosis of Cervical Cancer Cells

LAN Yanli,LIU Yun.

Xiangyang Central Hospital Affiliated to Hubei University of Arts and Science,Xiangyang,441021

ObjectiveTo study the influence of NCTD (noreantharidin) and ABT-737 on the proliferation and apoptosis of cervical cancer cells.MethodsMTT method was used to detect the influence of NCTD single-agent or joint ABT-737 on the proliferation of HeLa and SiHa cervical cancer cell lines;flow cytometry was used to analyze the influence of NCTD joint ABT-737 on the apoptosis of cervical cancer cells.ResultsNCTD single-agent can significantly inhibit the proliferation of HeLa and SiHa cervical cancer cell line(P<0.05),and the inhibitory effect was dose dependent.NCTD inhibition was enhanced after combination with ABT-737.Combination of NCTD and ABT-737 had more significant effect on promoting apoptosis than any single agent (P<0.05).ConclusionThe proliferation of SiHa and HeLa in cervical cancer cells is significantly inhibited by NCTD in vitro,the inhibition effect of ABT-737 and NCTD on proliferation and apoptosis is more obvious.

Cervical cancer;Cancer;Cantharidin;Cell proliferation;Cell apoptosis

441021 湖北文理学院附属襄阳市中心医院

刘韵

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.08.004

R737.33

A

1001-5930(2016)08-1230-04

2015-09-07

2016-02-07)