核桃肽酶解条件的研究

2016-09-15付慧彦诺利如一北京生物科技有限公司刘新旗北京工商大学郭诺利如一北京生物科技有限公司胡永生河北嘉好粮油有限公司

食品安全导刊 2016年21期

□ 付慧彦　诺利如一（北京）生物科技有限公司　刘新旗　北京工商大学郭　际　诺利如一（北京）生物科技有限公司　胡永生　河北嘉好粮油有限公司

核桃肽酶解条件的研究

□ 付慧彦诺利如一（北京）生物科技有限公司刘新旗北京工商大学
郭际诺利如一（北京）生物科技有限公司胡永生河北嘉好粮油有限公司

以核桃仁为原料，提取核桃油后，采用酶法制备核桃多肽，试验过程根据核桃蛋白及所使用酶的特性，研究了酶反应时底物浓度、酶添加量、反应前的液体的杀菌温度和杀菌时间，以及阻止核桃蛋白热凝聚的辅料对酶反应的DH和得率的影响。试验结果表明：当底物浓度为6%，添加0.3%卡拉胶，杀菌温度120 ℃，时间15 min，再添加复合酶10 000 U/g，反应温度58 ℃，pH值9.0，反应时间3.5 h,得到核桃肽DH为31.11%，核桃肽得率为60.75%。

核桃仁含有丰富的蛋白质，其主要由4类蛋白质构成，其中谷蛋白含量为70.1%，醇溶蛋白5.05%，球蛋白17.6%，清蛋白6.8%。核桃蛋白生物价、蛋白质净利用率和消化率都很高，其中的支链氨基酸和中性氨基酸含量都很高，是植物蛋白中营养价值很高的蛋白质，具有极高的深加工价值。

核桃蛋白的简介

核桃蛋白的氨基酸组成

研究分析了核桃蛋白的氨基酸组成，数据显示核桃蛋白主要由18种氨基酸组成，其中疏水性氨基酸和酸性氨基酸含量较高，分别占39.21%和30.13%，其含有的8种人体必需氨基酸的含量合理，占总氨基酸含量的31.82%，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量高。核桃蛋白能充分满足FAOWHO建议的于成年人所必需氨基酸的摄入，因此核桃蛋白是一种优质的植物蛋白。

核桃蛋白质特性

研究表明，核桃蛋白在pH5左右，溶解度最小，而在偏离pH5的酸性和碱性条件下，溶解度较高，因在偏离等电点的条件下，蛋白呈正离子和负离子状态，电荷互相排斥，分子分散性较好。

研究表明，核桃蛋白热稳定性差，核桃蛋白的热变性温度是67.05 ℃。其溶液在不同温度条件下的溶解度曲线图如图1所示。温度在58 ℃时，核桃蛋白质的NSI值最大，低于此温，NSI值随着温度的升高而增加，从58℃开始到67.05 ℃，NSI值开始急剧下降，67.05 ℃是核桃蛋白开始热变性的温度，从67.05 ℃开始核桃蛋白的NSI还是在下降，但是下降的速度有所缓解。这是因为温度较低时，核桃蛋白分子和水分子之间的相互作用力比较低，当温度适当增加时，核桃蛋白分子立体结构伸展，增加了核桃蛋白分子和水分子之间的相互作用力，起到增溶作用。当温度继续升高，超过核桃蛋白质的变性温度时，蛋白空间构象中的弱键断裂，破坏了肽键特定结构，原来包在分子内部的疏水基团暴露，分子间相互结合凝结沉淀，降低了核桃蛋白的溶解性。

材料与方法

试验材料

核桃仁：长白山，市售一级、无病虫害、成熟度高，达到采收标准。冷藏、备用。

试验试剂

氢氧化钠、三氯乙酸（分析纯）、硫酸（98%）、硫酸铜（分析纯）、硫酸钾（分析纯）、稀盐酸、硼酸（分析纯）以及指示剂：天津化学试剂厂；复合蛋白酶（诺维信生物科技有限公司）；黄原胶（阜丰集团）、大豆多糖（谷神集团）、卡拉胶（嘉吉中国）。

试验仪器与设备

图1　核桃蛋白溶液在不同温度条件下的溶解度曲线图

精密分析天平（龙腾）、恒温水浴锅（上海博讯）、pH计（梅特勒）、恒温干燥箱（上海博讯）、冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）、凯氏定氮仪（FOSS）以及高压锅（上海博讯）。

试验方法

1核桃肽制备过程

核桃肽制备过程，如图2所示。

2试验研究方案

为了确保核桃蛋白酶解过程不受其他有害微生物的影响，在核桃蛋白酶解之前需要进行高温杀菌，杀菌温度的高低直接影响了核桃蛋白的酶解效果和生产收率，由于核桃蛋白在67.05 ℃时会发生蛋白凝聚，导致核桃蛋白溶液的溶解性下降，影响了酶解程度和产品得率。因此，本实验的目的是通过研究核桃蛋白底物浓度、复合酶的添加量、辅料种类、辅料的添加量、杀菌时间以及杀菌温度得到核桃肽生产的最适宜的生产条件。

结果与讨论

酶解条件的优化

1底物浓度对水解度的影响

选取加酶量为10 000 U/g底物，酶解温度（58±2） ℃，pH值9.0，酶解时间3.5 h。以核桃蛋白质质量为基准，定容成3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%和12%的水溶液，测定核桃蛋白水解度DH和得率。结果如图3所示。可以看出，随着底物浓度的增加，DH和得率都呈现下降的趋势，但DH值变化较小，得率变化较大。实验现象看到，底物浓度超过6%时，核桃肽的得率和DH变化趋势减缓，所以核桃蛋白酶解液底物浓度选定为6%。

2复合蛋白酶添加量对DH和得率的影响

复合蛋白酶添加量为10 000 U/g时，核桃肽水解度和得率涨势最快，添加量超过10 000 U/g后，DH和得率虽然也在增长，但是，涨幅比较慢，所以试验选定酶添加量为10 000 U/g（如图4所示）。

辅料种类对核桃蛋白热凝聚性的影响

由于核桃蛋白中谷蛋白含量较高，其在67.05 ℃时就会发生热变性，变性状态分子暴露出来的疏水性基团是蛋白质的疏水相互作用达到最大，使得蛋白质凝聚。但是在核桃肽酶解之前，需要经过一次高温杀菌，以避免其他有害微生物影响酶解条件。杀菌的温度影响到核桃蛋白的热凝聚。因此，需要选定一种辅料来降低核桃蛋白的凝聚度，试验过程中选用了大豆多糖、黄原胶、卡拉胶作为抑制核桃蛋白凝聚的辅料。

1核桃蛋白热凝聚性的测定

一定量的核桃蛋白质溶液，溶解于pH9.0的水溶液中，在100 ℃加热30 min，3 000 rpm，离心30 min，取沉淀，充分水洗后，测定其蛋白质含量，与初始液体蛋白含量的比值，即可计算出凝聚的蛋白占总蛋白的比例。在同等条件下添加大豆多糖、黄原胶、卡拉胶和空白试验得出，卡拉胶对蛋白热凝聚抑制效果最显著，且在添加量低于0.3%时，热凝聚力下降的很快，超出0.3%时，下降的速度减缓（如图5所示）。因此，试验后选定0.3%的添加量的卡拉胶作为辅料，以达到抑制核桃蛋白热凝聚的目的。

图2　核桃肽制备流程

图3　底物浓度对水解度的影响

图4　复合蛋白酶添加量对DH和得率的影响

大豆多糖、黄原胶、卡拉胶都是一种亲水胶体，分子中含有亲水基团，对核桃蛋白形成一层保护层，又因其胶黏性，可以增加体系粘度，减少蛋白凝聚。卡拉胶中含有硫酸盐基团R-OSO3，其有阴离子性，能与蛋白发生相互作用，从而对胶束、胶团起稳定的作用，比其他胶体更能降低蛋白的热凝聚性。

2杀菌温度对酶解DH和得率的影响

不同的热处理工艺对核桃蛋白功能性有很大的影响。试验过程中，选定80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃和120 ℃的，杀菌时间条件15 min，添加0.3%卡拉胶进行灭菌，灭菌后酶解，底物浓度6%，复合酶添加量10 000 U/ g，反应液温度58 ℃，pH值9.0酶解3.5 h，反应后测其DH和得率。当杀菌温度低于120 ℃时，DH和得率都有显著增加，超过120 ℃时，增加的趋势减缓（如图6所示）。因此，选定杀菌温度为120 ℃。

3杀菌时间对酶解DH和得率的影响

试验过程中，选定杀菌温度为120 ℃，杀菌时间5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min，添加0.3%卡拉胶进行灭菌，灭菌后酶解，底物浓度6%，复合酶添加量10 000 U/g，反应液温度58 ℃，pH值9.0酶解3.5 hr，反应后测其DH和得率。杀菌时间低于15 min时，DH和得率增加，超过15 min时增加趋势减缓（如图7所示）。因此，选定杀菌时间为15 min。