不同强度重复经颅磁刺激对脑梗死大鼠条件性恐惧记忆的影响*

刘文贤，刘腾飞，张鑫，侯蓓蓓，余茜

（1西南医科大学附属医院康复科，四川泸州646000；2四川省人民医院康复科）

不同强度重复经颅磁刺激对脑梗死大鼠条件性恐惧记忆的影响*

刘文贤1，刘腾飞2，张鑫2，侯蓓蓓2，余茜1

（1西南医科大学附属医院康复科，四川泸州646000；2四川省人民医院康复科）

目的:研究不同强度重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation,，rTMS）对脑梗死大鼠条件性恐惧记忆的影响。方法:雄性成年SD大鼠40只，体重200～250 g，采用改良Zea longa线栓法对大鼠制作右侧大脑中动脉闭塞的脑梗死模型。建模成功的大鼠随机分为模型组及40%（0.76 T）、60%（1.14 T）、80%（1.52 T）强度刺激组，每组8只，另外假手术组8只。各刺激组大鼠于建模成功后第5 d开始按照设定参数分别接受磁刺激，连续5 d，假手术组和模型组置于相同磁场环境，但不接受磁刺激。治疗结束后，给予各组大鼠相同足底电击（55 V，2 s），在24 h后检测大鼠在5 min内的僵直持续时间。结果:各刺激组大鼠在接受足底电击24 h后的僵直持续时间均明显高于模型组（P＜0.01）,并且随着刺激强度的增加，大鼠在24 h后的僵直持续时间也明显增长（P＜0.01）。结论:rTMS能促进脑梗死大鼠记忆功能的恢复，并随着刺激强度的加强，大鼠记忆能力的恢复程度亦增强。

脑梗死；重复经颅磁刺激；恐惧记忆

脑梗死（cerebral infarction）是指因脑部血液供应障碍，缺血、缺氧所导致的局限性缺血性坏死或软化[1]。作为一种高发病率和高致残率的疾病，脑梗死给人类健康和生命带来威胁的同时也影响患者日常生活能力，给社会及家庭带来沉重的负担。重复经颅磁刺激技术（repetitive transcranial magnetic stimulation,，rTMS）是一种利用脉冲磁场作用于中枢神经系统（主要是大脑），改变皮层神经细胞的膜电位，使之产生感应电流，影响脑内代谢和神经电活动，从而引起一系列生理生化反应的磁刺激技术，作为一种新的精神神经系统治疗技术，具有无痛、无创、安全和操作简便等优点，目前已广泛应用于治疗帕金森病、癫痫、抑郁症、脑梗死、脊髓损伤等疾病的临床治疗中，并取得了较好的疗效[2-3]。条件性恐惧的形成是一种学习和记忆的过程，本研究旨在通过对脑梗死后大鼠条件性恐惧记忆的观察来研究rTMS对脑梗死后大鼠学习记忆功能的恢复作用，同时探索其治疗强度与功能恢复程度的关系，为rTMS将来更好地应用于临床脑梗死患者的治疗提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级成年SD雄性大鼠，体重约200～250 g（由第三军医大学实验动物中心提供），鼠龄12周，在饲养笼里给予12 h光/暗周期，可自由采食水和食物，随机取8只作为假手术组，其余大鼠制成右侧大脑中动脉栓塞脑梗死模型，将造模成功的大鼠随机分为模型组及40%（0.76 T）、60%（1.14 T）、80%（1.52 T）强度刺激组，每组8只。

1.2 仪器

武汉依瑞德公司生产的磁场刺激仪（CCY-1型）；自主设计制成的恐惧记忆条件训练箱[4]：训练箱材料为有机玻璃（20 cm×20 cm×20 cm），箱底由13根直径为5 mm（间隔10 mm）不锈钢丝作为电极的电极板。

1.3 脑梗死动物模型的制作

参照改良Zea longa线栓法[5]制成右侧大脑中动脉缺血模型。动物苏醒后表现为提尾时左侧前肢内收屈曲；同侧Horner氏征；爬行时向左划圈；站立时左侧倾倒。凡具有上述体征者列入研究对象。共用大鼠100只，有32只符合入选条件并存活到规定时间。假手术组仅作右侧颈内动脉结扎，术后无病理行为学改变。

1.4 治疗方法

刺激组在造模成功后第2 d行rTMS治疗，将大鼠头部固定，使其在刺激过程中保持清醒、安静和舒适。磁场线圈中心处于大鼠囟门右旁开0.5 cm处。设计刺激参数为：刺激频率1 Hz，刺激强度为40%（0.76 T）、60%（1.14 T）、80%（1.52 T）输出强度；3组/ d，5序列/组，20次/序列，每个序列间隔10 s，每组间隔60 s，连续刺激5 d，每天于14:00～15:00实施刺激，假手术组和模型组置于相同磁场环境，但不接受磁刺激。

1.5 记忆能力评价[6]

实验分为训练和检测两个部分，各组大鼠均于治疗结束后第2 d行场景性条件性恐惧实验。每次使用电击箱前用95%乙醇擦拭箱底和钢丝，将大鼠分别置于无声，无特殊气味的测试箱中，适应3 min后，开始给予短暂足底电击（55 V，2 s）共6次，2次足底点击时间间隔平均为90 s（60～120 s随机变化），最后1次电击结束后30 s将大鼠放回饲养笼。训练结束24 h后进行记忆形成和保持能力的测试，将大鼠放入同一电击箱中无电刺激呈现，观察并用秒表记录大鼠5 min内僵直（Freezing）反应时间。僵直的判定标准是动物接受刺激信号后,除呼吸运动外,全身其他躯体运动全部停止的状态。在这一行为模型中，僵直反应时间的长短反映大鼠对电击这一场景的恐惧记忆程度。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0版统计学软件包进行数据处理，每组样本数据用均数±标准差表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

与假手术组相比，模型组大鼠恐惧记忆能力明显下降，rTMS组大鼠恐惧记忆能力均明显高于模型组，各组间差异均有统计学意义（P＜0.01）,在刺激组中，随着刺激强度的增加，大鼠在24 h的僵直时间也明显增长，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 不同强度rTMS对脑梗死后大鼠条件性恐惧记忆的影响

3 讨论

重复经颅磁刺激（rTMS）是1991年在经颅磁刺激基础上发展起来的新的神经电生理技术，无痛无创、操作方便、安全可靠，能影响局部和远隔皮层功能，实现皮层功能区域性重建，影响多种神经递质和基因表达水平，目前在抑郁症、帕金森病、癫痫、神经性疼痛、脊髓损伤和脑卒中等疾病临床治疗中得到广泛的应用。临床研究表明，rTMS能促进脑梗死患者肢体功能的恢复和提高患者的日常生活能力[7]。目前研究中脑梗死大鼠学习记忆行为评估实验多以Y型迷宫和水迷宫为主[8-9]，条件性恐惧的形成也是一种学习和记忆的过程，本研究以条件性恐惧记忆作为学习记忆评估实验，结果显示rTMS能促进脑梗死大鼠记忆功能的恢复，并随着刺激强度的加强，脑梗死大鼠记忆能力的恢复程度亦增强。

目前，有关rTMS能促进脑梗死大鼠记忆能力恢复可能的机制研究较多。已有研究报道[10]，rTMS能促进脑梗死大鼠海马突触素（Syn）的表达，Syn是突触囊泡的一种特异标志性膜蛋白，其数量和分布密度可间接反映突触的密度，突触作为神经元之间在功能上发生联系的部位，其密度增多，海马区神经元之间的传递和联系随之增强；此外，磁刺激也可增加脑梗死侧皮层脑源性神经营养因子（BDNF）的表达，促进神经元再生,刺激轴突的芽生和新突触的形成，抑制促凋亡蛋白Bax、BAD等，从而对脑梗死部位产生多种神经保护效应[11]；另有研究报道[12]，rTMS治疗也能抑制缺血组织神经细胞的凋亡和增加神经可塑性，可用于脑梗死后亚急性期记忆功能恢复的治疗；另外，rTMS能调节miR-25/p57信号通路，能促进脑梗死后脑室下区成体神经干细胞的增殖，加强脑梗死后的自我修复能力[13]。

rTMS对脑梗死患者疗效作用与许多因素有关，主要因素则是刺激参数的设置如强度、频率、刺激持续时间等，本实验在保证除强度外的其它参数相同的前提下发现随着刺激强度的加强，大鼠记忆能力的恢复程度亦增强。有文献报道，这可能与磁刺激能影响星形胶质细胞的迁移有关，且随着刺激强度的增强，星形胶质细胞迁移能力也增强[14]。在保证治疗安全的前提下，本研究仅探讨不同强度重复经颅磁刺激对脑梗死后大鼠条件性恐惧记忆的影响，对其余参数如频率、刺激总量等对脑梗死治疗的量效关系有待进一步基础和临床研究。

考文献参

1.刘艳,于生元.脑梗死的诊断与治疗[J].中国乡村医药杂志,2005,7:3-4.

2.Sun W,Fu W,Mao W,et al.Low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation for treatment of refractory partial epilepsy[J].Clin EEG Neurosci,2011,42（1）:40-42.

3.张新,李建军.经颅磁刺激研究及应用进展[J].中国康复理论与实践,2006,12（10）：879-882.

4.宋海滨,李春林,金毅,等.两种小鼠恐惧记忆模型建立的比较研究[J].中国行为医学科学,2006,12:76-77.

5.廖维靖,刘淑红,范明,等.线栓阻断大鼠大脑中动脉制作缺血性脑损伤模型的改良[J].中华物理学会与康复杂志, 2002,6:24-26.

6.王兵廖,勇仕,梁日初,等.条件恐惧记忆形成中大鼠海马CA1区钙调蛋白激酶和蛋白磷酸酶1蛋白表达及活性变化[J].国际神经病学神经外科学杂志,2012,39:494-497.

7.钮竹,张通,方定华，等.经颅磁刺激在急性脑梗死运动功能康复中的作用[J].中国康复理论与实践,2001,07:16-18.

8.黄杰,颜南,王正东.康复训练对脑梗死大鼠学习记忆能力减退的影响[J].临床研究,2014,07:106-107.

9.Liu Xi,Yu Qian,Sheng Min.Effect of physical training on learning and memory ablity in rats with cerebral infarction[J].中国临床康复,2005,9:130-131.

10.周宁,吴洪阳,黄本荣,等.重复经颅磁刺激对脑缺血大鼠海马突触素表达及学习记忆的影响[J].神经损伤与功能重建,2015,1:05-07.

11.张小乔,梅元武,刘传玉,等.经颅磁刺激对脑梗死大鼠神经功能恢复与皮层BDNF表达的影响[J].卒中与神经疾病，2006,10:259-261.

12.Kyung Jae Yoon,Yong Taek Lee,Tai Ryoon Han.Mechanism of functional recovery after repetitive transcranial magnetic stimulation（rTMS）in the subacute cerebral ischemic rat model:neural plasticity or anti-apoptosis[J]. Exp Brain Res,2011,2:549-556.

13.Feng Guo,Xiaohua Han,Jinghui Zhang,et al.Repetitive transcranial magnetic stimulation promotes neural stem cell proliferation via the regulation of MiR-25 in a rat model of focal cerebral ischemia[J].PLOS ONE,2014,10:09-10.

14.李哲,方征宇,黄晓琳.不同强度经颅磁刺激对星形胶质细胞迁移的影响及其机制研究[J].中华物理医学与康复杂志，2010，4:249-252.

（2016-04-23收稿）

Effects of repetitive transcranial magnetic stimulation with different intensity on the conditioned fear memory in rats with cerebral infarction

Liu Wenxian1,Liu Tengfei2,Zhang Xin2,Hou Beibei2，Yu Qian11Department of Thoracic Surgery,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province，646000,China；2Department of Thoracic Surgery Sichuan Province Peoples Hospited

Objective:To study the effect of repetitive transcranial magnetic stimulation（repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS）with different intensity on the conditioned fear memory in rats with cerebral infarction.Methods:Forty male adult sprague-dawley rats,weighing 200～250 g,were performed right middle cerebral artery occlusion（MCAO）by modified Zea longa suture method to create cerebral infarction model.Model rats were randomly divided into a model group,40%（0.76 T）,60%（1.14 T）,80%（1.52 T）intensity stimulation group,and a sham operation group（n=8 in each group）.The rats in the rTMS group were treated with magnetic stimulation on the day after the infarction for a total of 5 days.The sham group and the model group were placed in the same magnetic field environment,but were not given any magnetic stimulation.At the end of treatment, each group was given the same foot shock,and the duration of Stupor response was recorded for 5 minutes after 24 h.Results:The duration of stupor response in rTMS groups receiving foot shock after 24 h was significantly longer than those in the model group（P＜0.01），and in rTMS groups,with the increasing intensity of the stimulation the durations of stupor response after 24 h were also significantly increased（P＜0.01）.Conclusion：rTMS can promote the memory recovery in rats with cerebral infarction,and with the increasing intensity of the stimulation the degree of memory recovery is also enhanced.

Cerebral infarction;Repetitive transcranial magnetic stimulation;Fear memory

R743.31

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.018

*四川省科技厅科研基金资助项目（编号:2014JY0032）

刘文贤（1991-），女，住院医师，硕士生

余茜（1968-），女，教授，博士，现四川省人民医院康复科工作。E-mail：Ygswcll@163.com