Flag和GFP双标记的SK2通道表达质粒的构建、鉴定和序列分析*

黄文俊，李涛，范学慧，余奕言，杨艳，曾晓荣，谭晓秋

（西南医科大学心血管医学研究所、医学电生理学教育部重点实验室、四川省心血管疾病防治协同创新中心，四川泸州646000）

论著

Flag和GFP双标记的SK2通道表达质粒的构建、鉴定和序列分析*

黄文俊，李涛，范学慧，余奕言，杨艳，曾晓荣，谭晓秋

（西南医科大学心血管医学研究所、医学电生理学教育部重点实验室、四川省心血管疾病防治协同创新中心，四川泸州646000）

目的：采用Overlapping PCR（重叠PCR）法进行人源SK2通道Flag和GFP融合表达质粒的构建，为下一步胞外运用Flag抗体进行SK2通道的转运调控研究奠定基础。方法：在既往克隆的人SK2通道基因的表达质粒pIRES-SK2的基础上，采用重叠PCR法构建Flag和GFP双标签标记的表达质粒pEGFP-N3-Flag-SK2（简写为Flag-SK2-GFP）。结果：构建的表达质粒Flag标签插入SK2通道的S1-S2胞外环区域，GFP标签连接SK2通道胞内的C末端，通过酶切、测序等证实质粒构建成功。结论：成功构建人心房肌SK2通道基因表达质粒Flag-SK2-GFP，为下一步研究SK2通道转运过程及调控机制奠定了基础。

小电导钙激活钾通道；重叠PCR；基因工程

近年来，小电导钙激活钾通道（small conductance calcium activated potassium channels,SK2）在人心房肌上被发现并且证明其在心肌细胞的复极化过程中扮演重要的角色[1-3]。由于SK2通道在心房肌的表达原高于心室肌，因此，寻找针对SK2通道调控的靶点将为房性心律失常（如心房颤动）的治疗提供新的思路[4-7]。对SK2通道的深入研究，尤其是调控机制的研究就显得尤为重要。目前异源表达表达离子通道在工具细胞如HEK293，CHO等已成为研究离子通道功能活动和药物筛选的主要方法之一，本研究旨在采用重叠PCR方法进行含标签的表达质粒的构建，为下一步研究SK2通道蛋白的转运过程以及功能活性奠定基础。

图1 重叠PCR构建融合表达质粒pEGFP-Flag-SK2示意图

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

主要试剂包括胶回收试剂盒（北京天根）、质粒提取试剂盒（北京天根）、PCR反应试剂（宝生物生物科技）、限制性内切酶（宝生物生物科技）、琼脂糖粉（Biowest公司）、LB培养基（上海生工），大肠杆菌DH5α（碧云天）、DNA Marker（碧云天）和连接反应试剂（Promega公司），其余试剂为国产分析纯。主要实验仪器有PCR仪（ABI公司）、紫外分光光度仪（Nanodrop公司）和离心机（Eppendorf公司）。

1.2 实验方法

本实验旨在已有编码人心肌SK2通道的表达质粒pIRES-SK2和pEGFP-N3的基础上，构建Flag和GFP双标签标记的SK2通道表达质粒Flag-SK2-GFP，其中Flag标签的氨基酸序列为：DYKDDDDK，拟将其插入SK2通道S1与S2跨膜序列的胞外侧连接处，插入后的氨基酸序列为：SNPIESDYKDDDDKCQNFYKDF。构建Flag标签的目的是用于检测SK2通道蛋白在细胞膜上的表达水平。GFP标签连接于SK2通道胞内的C末端，用于检测SK2通道蛋白在细胞整体的表达水平。本实验的基因克隆在实验室前期构建的表达质粒pIRES-SK2的基础上[8]，进行重叠PCR法和酶切连接完成的。引物序列见表1所示，引物由Invitrogen公司合成。

Flag标签插入pEGFP-N3-Flag-SK2的具体步骤和实验流程见图1所示：①将Flag（红色）插入到含有酶切位点Hind III和BamH I的表达质粒pIRES-SK2（蓝色）S1与S2胞外环的位点（图1A）。以质粒pIRES-SK2为模板，分段扩增包含有部分SK2通道和Flag标签的片段1和片段2（图1B）；②以片段1和片段2的混合片段为模板，使用片段1的上游引物和片段2的下游引物，进行重叠PCR反应得到包含有Flag的SK2通道片段3（图1C）；③选择酶切位点BamHⅠ和HindⅢ，采用双酶切法酶切质粒pEGFP-N3和片段3后，然后进行T4连接反应，将连接产物进行转化就得到含有Flag标签的SK2通道表达质粒pEGFP-N3-Flag-SK2（图1D）。

首先以pIRES-SK2质粒为模板，利用表1中引物分别扩增得到产物片段1和片段2（图2A）。再以片段1和片段2为模板，利用片段1的上游引物和片段2下游引物PCR扩增得到含Flag标签序列的片段3产物（图2B）。利用HindⅢ和BamHⅠ对片段3和pEGFP-N3进行双酶切，继而进行连接反应，从而可以将含有Flag标签序列的SK2序列克隆到pEGFP-N3载体，继而得到含有Flag和GFP双标记的SK2表达质粒pEGFP-N3-Flag-SK2（图3A）。将连接产物进行转化培养后提取质粒，酶切鉴定，测序。测序正确的质粒进行下一步实验。

PCR反应体系、酶切反应体系和连接反应体系都是根据试剂公司推荐的实验条件进行。PCR反应的退火温度根据引物的Tm降低2℃设置，酶切反应为37℃水浴过夜，连接反应为16℃水浴过夜。转化步骤按照碧云天大肠杆菌DH5α说明书进行。

表1 重叠PCR引物序列

2 结果

2.1 Flag标签插入质粒pIRES-SK2以及pEGFPN3-Flag-SK2质粒酶切鉴定

使用PCR分别得到含有部分SK2通道和Flag标签的片段1和片段2，PCR产物电泳结果如图2A所示，目标条带位置与预测大小基本一致。然后以这两个片段为模板，使用重叠PCR方法得到片段3后，Flag标签插入SK2通道S1-S2之间，同时还含有BamHⅠ与HindⅢ酶切位点，片段3条带大小约2 000 bp，电泳条带位置符合预期（图3B）。质粒pEGFP-N3双酶切后，与片段3进行连接反应，得到含有Flag标签的质粒pEGFP-N3-Flag-SK2。得到的质粒首先经过BamHⅠ与HindⅢ双酶切鉴定，结果如图2C所示，经BamHⅠ与HindⅢ双酶切之后能够得到一约2 000 bp左右的目的条带。

图2 重叠PCR产物电泳图

2.2 Flag-SK2-GFP质粒测序结果

测序结果显示：Flag插入SK2通道的S1-S2胞外环（图3B），GFP标签连接与SK2通道的胞内C末端（图3C）。

图3 Flag-SK2-GFP质粒结构示意图和测序结果

3 讨论

由于SK2通道在心房表达的特异性，同时又将胞内钙与膜电位相偶联，因此，SK2通道被认为房性心律失常的潜在治疗靶点[9]。既往研究发现，SK2通道在心房快速起搏的家兔心房肌表达量增加，更为重要的是心房快速起搏促进了SK2通道蛋白由胞浆向细胞膜的转运过程[10]。这提示我们，SK2通道转运过程在心房快速起搏（或房颤）是出现了异常，但是其深入机制未明。离子通道转运功能调节可能为疾病（心律失常）的治疗提供思路[11-12]。目前离子通道转运功能研究的策略较少，为此，本研究构建Flag与GFP双标记的SK2通道表达质粒Flag-SK2-GFP，其中Flag插于胞外环S1-S2之间，GFP连接于C末端。插入GFP标签的优势是可以直接使用激光共聚焦显微镜和活细胞工作站、流式细胞术等技术实时、动态的观察活细胞SK2通道蛋白的转运过程和调控机制。插入Flag标签是基于目前直接针对SK2通道蛋白胞外抗体的特异性和亲和力较差，不能准确反映通道蛋白在细胞膜上的表达水平。而针对Flag标签抗体的特异性和亲和力要高很多，因而更能准确的研究SK2通道在细胞膜上的表达水平。由于仅仅只有离子通道在细胞膜上表达的高低是不能准确反映通道蛋白在向细胞膜转运的过程是促进还是抑制，结合GFP荧光强度代表SK2通道的总体表达水平，可以使用流式细胞术、共聚焦显微成像技术等准确地研究细胞膜上通道蛋白与整体表达水平之间的比例关系，从而更加准确反映通道蛋白的转运效率。因此，采用Flag标签抗体研究蛋白定位和表达时，比直接使用目的蛋白的抗体阳性率、准确性均有明显提高，同时还能降低研究的科研成本，是一项可以值得推广的研究策略。而采用该质粒，结合配套的荧光显微镜膜片钳系统，研究SK2通道的电生理特性及其药物作用机制，大大提高实验效率并简化筛选稳定表达克隆的过程。

此外，本实验利用的重叠PCR技术具有不需要限制性内切酶的消化和连接酶的处理的特点，可以很好的用于在融合基因的构建、长片段基因的扩增等方面。

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2.L.Skibsbye,C.Poulet,J.G.Diness,et al.Small-conductance calcium-activated potassium（SK）channels contribute to action potential repolarization in human atria[J]. Cardiovasc Res,2014,103（1）:156-67.

3.S.Mahida.Expanding role of SK channels in cardiac electrophysiology[J].Heart Rhythm,2014,11（7）:1233-8.

4.J.G.Diness,U.S.Sorensen,J.D.Nissen,et al.Inhibition of small-conductance Ca2+-activated K+channels terminates and protects against atrial fibrillation[J].Circ Arrhythm Electrophysiol,2010,3（4）:380-90.

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6.C.H.Hsueh,P.C.Chang,Y.C.Hsieh,et al.Proarrhythmic effect of blocking the small conductance calcium activated potassium channel in isolated canine left atrium[J]. Heart Rhythm,2013,10（6）:891-8.

7.X.D.Zhang,D.K.Lieu,N.Chiamvimonvat.Smallconductance Ca2+-activated K+channels and cardiacarrhythmias[J].Heart Rhythm,2015,12（8）:1845-1851.

8.谭晓秋,陈桂兰,李涛,等.重叠PCR法构建人心房肌SK2（KCNN2）基因表达质粒及鉴定和序列分析[J].中国应用生理学杂志,2012,28（4）:381-384.

9.J.G.Diness,B.H.Bentzen,U.S.Sörensen,et al.Role of Calcium-activated Potassium Channels in Atrial Fibrillation Pathophysiology and Therapy[J].J Cardiovasc Pharmacol,2015,66（5）:441-8.

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（2016-04-23收稿）

Construction of SK2 channel expression plasmid with double labeling of Flag and GFP

Huang Wenjun,Li Tao,Fan Xuehui,Yu Yiyan,Yang Yang,Zen Xiaorong,Tan Xiaoqiu
Institute of Cardiovascular Research,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province，646000, China；the Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education；Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease

Objective：This study aimed to construct a SK2 channel plasmid with two tags using overlapping PCR to provide the easiness to track the transportation of the channel protein.Methods：Based on human SK2 channel expression plasmid pIRES-SK2,the full length of SK2 cDNA with a Flag insertion was amplified using overlapping PCR method,which was then subcloned into pEGFP-N3 vector.The double-tagged expression plasmid,pEGFP-N3-Flag-SK2（Flag-SK2-GFP）was confirmed by DNA sequencing.Results：A Flag tag was inserted in-between the S1-S2 extracellular loops of SK2 channel whose C-terminus was fused in-frame to GFP. The constructed plasmid was further confirmed by DNA sequencing.Conclusion：The expression plasmid Flag-SK2-GFP was constructed successfully with overlapping PCR.

Small conductance calcium activated potassium channels;Overlapping PCR;Gene cloning

R972.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.009

*国家自然科学基金资助项目（NO：31300948；81670310），四川省科技厅支撑计划（2011FZ0106），泸州市-四川医科大学联合资助项目（2015LZCYD-S03）

黄文俊（1983-），女，助理研究员，硕士

谭晓秋（1981-），男，副研究员。E-mail：tanxiaogiu1981@163.com