阿魏酸钠与弥可保治疗糖尿病周围神经病变模型大鼠心肌 TGF和 CTGF表达的研究

李晓雯，李艳丽，陈思思，廖勇敢

（湖北医药学院附属人民医院，湖北　十堰　442000）

阿魏酸钠与弥可保治疗糖尿病周围神经病变模型大鼠心肌TGF和CTGF表达的研究

李晓雯，李艳丽，陈思思，廖勇敢

（湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000）

目的 探讨应用阿魏酸钠与弥可保对糖尿病周围神经病变模型大鼠心肌的TGF和CTGF表达的效果。方法 选取90只4个月龄的SD雄性大鼠，随机均分为对照组、糖尿病周围神经病变组、阿魏酸钠干预组、弥可保干预组、阿魏酸钠与弥可保干预组，每组15只，分别观察测定实验后大鼠的体重、血糖、胰岛素及心肌CTGF和TGF的变化。结果 与对照组比较，其余各组体重均下降，血糖、胰岛素、心肌CTGF与TGF均有所升高，但是其余各干预组体重、血糖、胰岛素、心肌CTGF与TGF指标均比糖尿病周围神经病变组有所改善，其中阿魏酸钠与弥可保组效果更明显（P＜0.05）。结论 阿魏酸钠和弥可保均能抑制糖尿病大鼠心肌CTGF及TGF-β1的表达，起到心脏保护作用，两药联用具有协同作用，为临床治疗提供了借鉴。

阿魏酸钠； 弥可保； 糖尿病周围神经病变； TGF； CTGF

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.029

收稿日期：2015-08-26；修回日期：2015-10-08

通讯作者：廖勇敢

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）属于糖尿病的并发症，在糖尿病的并发症中较为常见［1］。目前对糖尿病周围神经病变的发病机制尚不清楚，但是有发现表明促进心肌纤维化的炎性、细胞因子-结缔组织生长因子（CTGF）和转化生长因子（TGF）参与其发病过程［3］。本研究就通过建立糖尿病大鼠模型，对阿魏酸钠与弥可保治疗糖尿病周围神经病变模型大鼠心肌TGF和CTGF的表达作用进行初步探讨。

资料与方法

1 一般资料及造模

本研究选取90只4个月龄的SD雄性大鼠，质量为84～98g，均购自湖南省实验动物研究中心。购来后用鼠笼喂养，适应性喂养1周，让其自由摄食与饮水。随机均分为对照组、糖尿病周围神经病变组、阿魏酸钠干预组、弥可保干预组、阿魏酸钠与弥可保干预组，每组15只。本研究使用的阿魏酸钠，均购自广东众生公司，批号为140109；弥可保，均购自诺华制药公司，批号为131109。

大鼠糖尿病周围神经病变模型的建立：对所有大鼠均禁食12小时后，①正常组（NC）15只，饲喂普通饲料，一个月后以30mg/kg剂量腹腔注射0.1mmol/L枸橼酸缓冲液（pH 4.2，4℃）），3天后测定非同日的血糖变化，连续3次测定大鼠的空腹血糖均小于11.1mmol/L且非空腹血糖均小于16.7mmol/L，观察一周其血糖较稳定，为对照组鼠；②对糖尿病周围神经病变组、阿魏酸钠干预组、弥可保干预组、阿魏酸钠与弥可保干预组的75只大鼠均进行高脂高糖饮食（普通饲料+10%蔗糖+20%猪油），一个月后，以30mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素（STZ）溶液 （用0.1mmol/L枸橼酸缓冲液（pH4.2，4℃）配成2%浓度），3天后测定非同日的血糖变化，连续3次测定大鼠的空腹血糖均大于11.1mmol/L且非空腹血糖均大于16.7mmol/L，观察一周其血糖较稳定，本次造模成功［4］。

2 实验方法

用蒸馏水制备阿魏酸钠溶液（15mg/mL）与弥可保溶液（15mg/mL），配制后储存于4℃冰箱中。除对照组、糖尿病周围神经病变组灌服等容量的蒸馏水、阿魏酸钠与弥可保干预组按照每天各2.5mL/kg体积给药外，其它各组均按照每天5mL/kg体积给药，每天1次，连续2个月，实验过程中，饲养大鼠的其它条件不变，均饲喂普通饲料、正常饮水等［5］。在灌胃给药过程中，有大鼠死亡，最终进行实验的大鼠数量如下：对照组15只、糖尿病周围神经病变组14只、阿魏酸钠干预组14只、弥可保干预组15只、阿魏酸钠与弥可保干预组14只。

3 观察指标及标本的采集

观察指标包括大鼠的一般状态、体重、血糖以及心肌组织的TGF-β1和CTGF的测定，分别观察各组大鼠的情况［6］。

其中一般状态包括大鼠的精神、形体的状态，观察大鼠皮毛的色泽，运动情况等；

体重测定：实验开始时、实验结束1个月后、2个月后各记录一次大鼠的体重，用电子称称重；

实验后2个月，大鼠腹腔中注射20%的乌拉坦（5mL/kg）进行麻醉，在固定架上固定，测定迅速取出心脏，在预冷的盐水中冲洗后进行重量的测定。部分心肌组织置于液氮中保存，用于TGF-β1和CTGF的测定。抽取主静脉血液进行血糖和胰岛素的测定。

血糖和胰岛素的测定［7］：大鼠的血糖采用Surestep血糖仪测定，胰岛素采用放免法测定，试剂盒均购自北京普尔伟业生物科技有限公司，严格按照上述试剂盒说明书操作。

TGF-β1和CTGF的测定［8］：采用western blot的方法测定TGF-β1和CTGF的表达量。一抗采用Sigma的兔抗鼠TGF-β1和CTGF多克隆抗体，1∶200稀释使用。采用辣根过氧化物酶标记的二抗，1∶2000稀释。以光密度表示TGF-β1和CTGF的表达量。

4 统计学方法

对文中所得数据采用SPSS13.0软件进行统计学处理并作比较分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1 一般状态

除对照组外，各组大鼠均出现明显多饮、多尿、多食、体重下降、皮毛污秽无光泽、精神萎靡、动作迟缓等现象，各治疗组大鼠情况均好于糖尿病周围神经病变组，其中，阿魏酸钠与弥可保干预组大鼠变化改变情况最少。

2 大鼠体重变化情况

实验开始时各组动物的体重比较无显著性变化，实验的第1个月与第2个月，与对照组比较各组大鼠体重均有不同程度的下降，糖尿病周围神经病变组的体重下降的更明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）；第1个月与第2个月的结果显示，阿魏酸钠与弥可保干预组、阿魏酸钠干预组、弥可保干预组与糖尿病周围神经病变组比较体重均上升，且阿魏酸钠与弥可保干预组比阿魏酸钠干预组、弥可保干预组体重明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　各组大鼠体重比较（x±s，g）

3 实验后2个月大鼠血糖与胰岛素的变化情况

实验结束后2个月对大鼠血糖与胰岛素进行分析，与正常对照组相比，各组大鼠血糖均显著升高，但是除对照组以外，与糖尿病周围神经病变组比较，阿魏酸钠与弥可保干预组、阿魏酸钠干预组、弥可保干预组血糖均降低，阿魏酸钠与弥可保干预组降低较为明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　各组大鼠血糖与胰岛素的比较（x±s）

4 实验后2个月大鼠TGF-β1和CTGF表达的变化情况

实验结束后2个月对大鼠对大鼠TGF-β1和CTGF进行分析，与对照组比较，阿魏酸钠与弥可保干预组、阿魏酸钠干预组、弥可保干预组、糖尿病周围神经病变组的TGF-β1和CTGF均有所升高；除对照组以外，阿魏酸钠与弥可保干预组、阿魏酸钠干预组、弥可保干预组与糖尿病周围神经病变组比较，TGF-β1和CTGF均有所降低，且阿魏酸钠与弥可保干预组降低的更多，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，阿魏酸钠与弥可保均可以改善大鼠心肌细胞的TGF-β1和CTGF的表达，且同时使用具有协同作用，效果更佳。见表3。

表3　各组大鼠TGF-β1和　CTGF表达比较（x±s，pg/mL）

讨 论

近年来糖尿病的发病率逐渐升高，伴随的并发症也不断出现，医学工作者已经开始对糖尿病周围神经病变逐步重视，是研究的重点［9］。人们建立了多种用于其病理机制研究和治疗药物研究的动物模型，有STZ诱发的大鼠、小鼠、狗、转基因大鼠和小鼠自发性糖尿病模型等糖尿病动物模型［10］。有研究发现，STZ诱发的糖尿病大鼠模型是最为常用的糖尿病模型，因为这种模型在早期的功能、生化、病理等的异常变化与人类的相似，结构改变在I型、II型糖尿病模型中，因此，本研究选择了注射STZ诱发大鼠糖尿病动物模型，也是目前应用最多的一种模型，且此模型制备方法便于操作，大鼠死亡率低。

糖尿病周围神经病变中存在着心肌结构紊乱，即心肌纤维化，其中，与糖尿病的心肌纤维化关系最密切的是血纤维蛋白溶酶原生长因子，包括TGF和CTGF。TGF-β是可以使心脏纤维变性和心肌细胞肥大的生长因子，它有促进纤维细胞生长、调节细胞周期、细胞分化、免疫调节等功能［11］。已发现TGF-β有5种异构体（TGF-β1～TGF-β5），其中TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3主要见于哺乳动物，TGF-β1过度表达与心肌细胞肥大和心肌纤维化密切相关，TGF-β1可以抑制基质金属蛋白酶、增强胶原酶抑制剂的表达、增加TIMP-1基因的表达。高糖环境可以上调TGF-β1和CTGF表达、活性，使左心室基质沉积，而在糖尿病心肌纤维化中TGF-β1活化，同时伴随着半乳糖凝集素的激活，被认为在诱导组织纤维化过程中是关键步骤，所以本研究着重测定TGF-β1的变化情况［12］。CTGF为半胱氨酸的分泌肽，有研究发现CTGF对成纤维细胞具有趋化、促细胞增殖、促进有丝分裂等的作用，CTGF与血管、心脏、胰腺、肝脏等在内的许多组织器官纤维化相关。CTGF是与糖尿病周围神经病变心肌纤维化相关的重要细胞生长因子。

本研究发现，各干预组的体重、血糖、胰岛素、心肌TGF-β1和CTGF的表达水平均较糖尿病周围神经病变组具有较好的恢复，且阿魏酸钠与弥可保干预组效果更好，差异具有统计学意义（P＜0.05）。综述所述，阿魏酸钠与弥可保不仅能够降脂降糖，在心血管方面的治疗中也有一定的保护作用，能够降低TGF-β1和CTGF的表达，对糖尿病的研究提供了一定的借鉴。

［1］杨祖蓉.阿魏酸钠治疗糖尿病周围神经病变的疗效观察.四川医学，2012，1（2）：257-258.

［2］Tsai H C，Huang C Y，Su H L，et al.CTGF increases drug resistance topaclitaxelbyupregulatingsurvivinexpressioninhuman osteosarcoma cells.Biochim Biophys Acta，2014，1843（5）：846-854.

［3］王昱.阿魏酸钠并弥可保治疗60例糖尿病周围神经病变疗效观察.中国实用医药，2012，7（32）：133-134.

［4］莫顺瑶.阿魏酸钠联合高压氧治疗糖尿病周围神经病变的护理分析.中国医药指南，2013，11（35）：569-570.

［5］罗嘉，黄佳，叶茂.厄贝沙坦对2型糖尿病模型大鼠心肌TGF-β1 和CTGF表达的影响.标记免疫分析与临床，2015，22（7）：669-671.

［6］乔进，施忠，窦志华，等.灵芝多糖联合二甲双胍对糖尿病大鼠心肌纤维化的干预.中国医院药学杂志，2014，34（20）：1709-1713.

［7］习雪峰，冯守东，张林，等.游泳运动对2型糖尿病大鼠心肌TGF-β1/CTGF基因表达和胶原代谢的影响.河南大学学报（自然科学版），2014，44（6）：706-710.

［8］王中英，庞淑珍.阿魏酸钠联合弥可保治疗糖尿病周围神经病变57例疗效观察.中国实用神经疾病杂志，2012，15（20）：34-35.

［9］邓向军，胡秀梅，武谦虎.伊伐布雷定对糖尿病大鼠心肌的保护作用及机制探讨.安徽医药，2014，18（12）：2248-2250.

［10］王国贤，康雅萍，李飞.α-硫辛酸对糖尿病肾病模型大鼠肾组织转化生长因子-β1和结缔组织生长因子表达的影响.江苏大学学报（医学版），2012，22（5）：378-381，386.

［11］Cheng M，Liu F，Peng Y，et al.Construction of a CTGF and RFP coexpressed renal tubular epithelial cell and its application on evaluation of CTGF-specific siRNAs on epithelial-mesenchymal transition.Urology，2014，83（6）：e1-8.

［12］刘根林，袁风菊，陆慈溧，等.银杏叶提取物对Ⅰ型糖尿病心肌病大鼠心肌TGF-β1和collagen表达及间质纤维化的影响.中国病理生理杂志，2013，29（11）：2017-2023.

（李 凌编辑）

Expression of Myocardial TGF and CTGF in Diabetic Peripheral Neuropathy Model Rat After Treatment with Sodium Ferulate and Mecobalamin

LI Xiao-wen，LI Yan-li，CHEN Si-si，LIAO Yong-gan
（Endocrine DepartmentPeople's Hospital Affiliated to Hubei Medical College，Shiyan 442000，China）

Objective To investigate the effect of sodium ferulate and Mecobalamin on myocardial TGF and CTGF expression in diabetic peripheral neuropathy model rat.Methods Ninety of four month old male SD rats were randomly divided into normal control group，diabetes peripheral neuropathy group，sodium ferulate intervention group，Methycobal intervention group，ferulic acid sodium and mecobalamin intervention group，with 15 rats in each group.The changes of rat body weight，blood glucose，insulin and myocardial CTGF and TGF were measured after the experiment.Results Compared with normal control，the body weight in other groups were decreased，but the blood glucose，insulin，myocardial CTGF and TGF levels were increased.The above indexes in intervention group were improved compared with the diabetic peripheral neuropathy group，and sodium ferulate combined with methylcobalamin intervention group showed Bulgaria effect more obviously（P＜0.05）. Conclusion Sodium ferulate and Methycobal can inhibit expression of myocardial CTGF and TGF beta 1 in diabetic rats.The combination of two drugs has a synergistic effect and provides the reference for the clinical treatment.

Ferulic acid sodium； Methylcobalamin； Diabetic peripheral neuropathy； TGF； CTGF