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纳米氧化锌对甜瓜主要致病菌抑菌活性研究

2016-09-14王虎军薛华丽南米娜甘肃农业大学理学院甘肃兰州70070甘肃农业大学农业资源化学与应用研究所甘肃兰州70070甘肃农业大学食品科学与工程学院甘肃兰州70070

食品工业科技 2016年4期
关键词:氧化锌甜瓜抑制率

王虎军,路 军,薛华丽,,*,赵 军,*,毕 阳,南米娜(.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州70070;2.甘肃农业大学农业资源化学与应用研究所,甘肃兰州70070;.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州70070)

纳米氧化锌对甜瓜主要致病菌抑菌活性研究

王虎军1,2,路军1,薛华丽1,2,3,*,赵军1,*,毕阳3,南米娜1,2
(1.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州730070;
2.甘肃农业大学农业资源化学与应用研究所,甘肃兰州730070;
3.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州730070)

为研究纳米氧化锌对引起采后甜瓜粉霉病、白霉病和黑斑病的主要致病菌粉红单端孢(Trichothecium roseum)、镰刀菌(Fusarium spp.)、交链孢(Alternaria)的抑制效果,本文通过不同浓度的固相和液相纳米氧化锌对粉红单端孢(T.roseum)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、互隔交链孢(Alternaria alternate)三种菌分别进行体外、体内抑菌活性实验研究。体外实验结果表明:固相和液相纳米氧化锌对这三种病原菌菌丝生长、孢子萌发均具有明显的抑制作用,且随着溶液浓度的增大,抑制效果增强;固相纳米氧化锌较液相具有更佳的抑菌效果,且对T.roseum的抑制作用最强,其次是F.sulphureum、A.alternate。体内实验结果表明,固相和液相纳米氧化锌处理均可显著抑制由T.roseum、F.sulphureum、A.alternate损伤接种甜瓜果实病斑直径的扩展。故两种性状纳米氧化锌均可通过抑制甜瓜采后主要致病菌的生长来减轻甜瓜采后病害,且固相纳米氧化锌较液相纳米氧化锌效果更为明显。

纳米氧化锌,T.roseum,F.sulphureum,A.alternate,抑菌

甜瓜是我国西北地区一种重要的经济作物,因其外形美观,风味独特,而深受广大消费者喜爱[1-2]。但由于其成熟期相对集中,且正处于高温季节,加之缺乏有效的冷链设施,采后病害颇为严重[3]。甜瓜采后的病害与多种病原菌有关,其中由T.roseum、Fusarium spp.、Alternaria分别引起的粉霉病、白霉病、黑斑病是甜瓜腐烂损失的重要原因[4-5]。化学杀菌剂虽然可有效控制甜瓜采后病害的发生,但由于药物残留、环境污染以及诱导病原物产生抗药性等问题而使其使用受到了限制,故新型抑菌剂的研究已成为一种必然趋势[6]。

氧化锌具有良好的热稳定性、持久性,且作为人体所必需的微量元素,与人体相容性好等独特性质,使之成为良好的无机抑菌材料[7]。纳米氧化锌又称为超微细氧化锌,因其颗粒大小处于纳米级别、比表面积大,故纳米氧化锌的生物活性较其本体得到很大提升,越来越受到人们的青睐[8]。目前,关于纳米氧化锌的抑菌作用研究主要集中在细菌方面,朱志宏等[9]研究表明,液相纳米氧化锌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有良好的抑制效果。高艳玲等[10]研究证实,纳米氧化锌对枯草芽孢杆菌的抑制能力最强,其次是伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,然而对李氏杆菌没有抑制作用。刘瑾瑾等[11]研究发现,纳米氧化锌可直接抑制由A.alternate和P.expansum引起的苹果黑斑病、青霉病。但目前有关纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum、A.alternate真菌的抑制作用研究未见报道,且不同性状纳米氧化锌的抑菌作用存在差异。为此,本文以不同性状、不同浓度的纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum和A.alternate的抑菌效果进行研究,以期为甜瓜采后病害的控制提供一定的理论参考。

1 材料及方法

1.1材料及仪器

白雪公主甜瓜2015年4月购于兰州市安宁区铝厂果蔬市场,选择大小均匀、外观无损伤的果实,单个套袋纸箱包装后运抵本校实验室,室温(20±2)℃贮藏待用;粉红单端孢(Trichothecium roseum)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、互隔交链孢(Alternaria alternate)均由甘肃省农业科学研究院提供;纳米氧化锌由甘肃农业大学理学院提供,固相纳米氧化锌以七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)和氯化钠(NaCl)(质量比为1∶2),氢氧化钠为原料采用固相研磨法一步合成,并经X射线衍射(XRD)、透射电镜(TEM)、红外光谱(IR)进行表征测定,平均粒径为20 nm;液相纳米氧化锌以碳酸钠(NaCO3)和七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)(体积比为1∶1)为原料采用直接沉淀法制备,并经X射线衍射(XRD)、透射电镜(TEM)、红外光谱(IR)进行表征测定,平均粒径为30 nm;噻唑蓝(纯度>98.0%) 购于上海源聚生物科技有限公司。

SW-CJ-2FD型超净工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;VXH-3型微型漩涡混合器上海跃进医疗器械厂;CX21FS1C型生物显微镜镜奥林巴斯(广州)工业有限公司;DHP-9272B型恒温培养箱上海一恒科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1孢子悬浮液的制备根据刘瑾瑾等[11]的方法并修改。将实验菌于PDA培养基中25℃下活化7 d,然后取带菌PDA平皿一个,加入无菌水约10 mL,用无菌的玻璃涂布器刮下平板上的实验菌孢子,以无菌双层纱布过滤至50 mL无菌小烧杯中,滤液用血球计数板计数,计算出孢子悬浮液的浓度,然后稀释至所需浓度(1×106孢子/mL)。

1.2.2最低抑菌浓度(MIC)的测定根据Li等[12]方法并略做修改,将96孔培养板紫外照射10 min,然后向每孔中加入100 μL无琼脂察氏培养基,于第1列加入100 μL的纳米氧化锌,混匀后吸出100 μL置于第2列,依次稀释至第10列,第10列混匀后吸出100 μL弃去;然后每孔加入20 μL的菌悬液,各浓度设3个平行,最后一列作为对照加入无菌水。最后于各孔加入20 μL 0.5 mg/mL的噻唑蓝指示剂,盖好培养板并在25℃培养24~48 h,观察指示剂颜色变化,并记录最低抑菌浓度。以上操作均在无菌条件下进行,所用试剂及器材均已灭菌。

1.2.3纳米氧化锌处理对菌丝生长的影响根据He等[13]方法并略作修改,先将纳米氧化锌分别置于150 mL PDA培养基中,使其终浓度为MIC的1、2、4倍,以不添加纳米氧化锌作为对照,混合均匀经灭菌后分别倒入90 mm培养皿中,待培养基冷却凝固后,接种T.roseum、F.sulphureum、A.alternate病原菌菌饼(直径10 mm),25℃避光恒温培养,3 d后十字交叉法测定其菌落直径并记录,每个处理平行3次。抑菌率的计算如下:

抑菌率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-原菌饼直径)×100

1.2.4纳米氧化锌处理对孢子萌发的影响根据刘瑾瑾等[11]方法并略作修改,用无菌打孔器打取直径为10 mm的2%琼脂培养基,用无菌镊子将其置于灭菌的载玻片上,将载玻片置于已灭菌且装有湿润滤纸的培养皿中,然后分别滴加20 μL纳米氧化锌溶液于培养基上,所加纳米氧化锌浓度分别为MIC的5、25、125倍,以加入同体积无菌水作为对照,再在其上加入20 μL孢子悬浮液,盖上盖玻片。25℃下连续镜检数小时,直到对照基本完全萌发。每次镜检至少200个孢子,重复3次。

1.2.5纳米氧化锌处理对甜瓜病斑直径的影响依据毕阳等[14]方法并修改。选择大小均一的无病虫害甜瓜果实,用清水进行清洗,然后以2%NaClO液浸泡消毒4 min,待晾干后用70%酒精表面消毒,再用无菌打孔器(深度8 mm,直径2 mm)在赤道部位均匀打取4个孔,待孔内汁液晾干后,分别向孔内注射1×106个/mL的孢子悬浮液20 μL,3 h后再分别在纳米氧化锌溶液中浸泡3 min,液相纳米氧化锌浓度为3.00、6.00、9.00 mg/mL;固相纳米氧化锌浓度为0.30、0.60、0.90 mg/mL,以无菌水处理为对照,甜瓜处理之后用PE薄膜包裹,在(20±2)℃下贮藏,待明显发病后测量病斑直径。

1.3数据处理

数据处理采用Excel 2013和SPASS 19.0统计软件进行邓肯氏多重差异分析(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1最低抑菌浓度

纳米氧化锌对各实验菌的最低抑菌浓度(MIC)值如表1所示。由此可知,两种性状的纳米氧化锌对T.roseum,F.sulphureum,A.alternate均具有抑制活性。同时,固相纳米氧化锌对这三种病原菌的抑菌效果优于液相纳米氧化锌,如:对T.roseum、F.sulphureum的抑制作用中,固相纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum的最低抑菌浓度均为液相纳米氧化锌的6.7倍,而A.alternate的抑制作用中,固相纳米氧化锌是液相纳米氧化锌的7.5倍。

此外,两种纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum的抑菌效果均优于A.alternate,如液相纳米氧化锌对A.alternate的最低抑菌浓度均为T.roseum、F.sulphureum 的3倍,固相纳米氧化锌对A.alternate的最低抑菌浓度均为T.roseum、F.sulphureum的2.7倍。由于抑菌浓度越低,表明抑菌效果越好,故两种纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum抑制效果均强于对A.alternate的抑制效果。

表1 纳米氧化锌对各实验菌种的MIC值Table 1 The MIC value of nano-ZnO against fungus

2.2纳米氧化锌对菌丝生长的影响

由表2可知:无论固相、还是液相纳米氧化锌,其对T.roseum、F.sulphureum、A.alternate均具有抑制效果;对于液相纳米氧化锌,在0.00~0.80 mg/mL范围内,随着纳米氧化锌浓度的增加,这三种菌的菌丝生长抑制率亦呈现相应上升的趋势。在0.00~0.20 mg/mL范围内,T.roseum抑制率的上升趋势较F.sulphureum明显,之后趋势又趋向平缓;当浓度为0.20 mg/mL时,T.roseum的抑制率为55.6%,明显的高于F.sulphureum的抑制率31.4%;所以液相纳米氧化锌对T.roseum的抑制作用强于F.sulphureum。

对于固相纳米氧化锌,在0.00~0.12 mg/mL的范围内,对T.roseum与F.sulphureum呈现明显的抑制作用,且随着浓度的增加抑制率也相应增大;在0.00~0.32 mg/mL范围内,对A.alternate的抑制率也随着浓度的增加呈上升趋势。在0.00~0.03 mg/mL范围内,对T.roseum与F.sulphureum抑制率上升趋势都较为显著,A.alternate趋势相对平缓,故T.roseum和F.sulphureum对纳米氧化锌较A.alternate敏感,当纳米氧化锌浓度为0.03 mg/mL时,T.roseum的抑制率为28.0%,高于F.sulphureum的20.6%,故T.roseum较F.sulphureum更为敏感。

2.3纳米氧化锌对孢子萌发的影响

据表3可知,纳米氧化锌对孢子的萌发具有明显的抑制作用。当浓度为1.00 mg/mL和5.00 mg/mL的液相纳米氧化锌分别处理T.roseum、F.sulphureum时,T.roseum的孢子萌发率分别为对照的76.5%、70.7%,F.sulphureum的孢子萌发率分别为对照的76.6%、72.1%,这两种浓度处理对T.roseum、F.sulphureum的孢子萌发率影响并不是很明显;但当浓度为25.00 mg/mL时,T.roseum孢子萌发率仅为对照的51.3%,F.sulphureum孢子萌发率仅为对照的54.4%,该浓度下表现出显著的影响。同样,浓度为3.00 mg/mL 和15.00 mg/mL的液相纳米氧化锌处理A.alternate的孢子时,其萌发率分别为对照的81.0%、79.9%,对其孢子萌发率的影响并不显著。而当浓度为75.00 mg/mL时,对A.alternate的萌发率为对照的62.5%。

表2 纳米氧化锌对T.roseum,F.sulphureum,A.alternate菌丝生长影响Table 2 Effect of zinc oxide nanoparticles on mycelial growth of T.roseum,F.sulphureum,A.alternate

表3 纳米氧化锌对T.roseum,F.sulphureum,A.alternate孢子萌发的影响Table 3 Effect of zinc oxide nanoparticles on spore germination of T.roseum,F.sulphureum,A.alternate

固相纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum的孢子萌发率实验中,浓度为0.03 mg/mL时,对T.roseum、F.sulphureum孢子萌发率的影响不是太明显,而当浓度为0.80 mg/mL时这两种菌的孢子萌发率分别是对照的63.7%和69.2%。对A.alternate孢子萌发率的影响中,浓度为0.08、0.40 mg/mL时对孢子萌发率的影响不显著,然而当浓度为2.00 mg/mL时,其孢子萌发率是对照的65.9%。

2.4纳米氧化锌对甜瓜病斑直径的影响

由表4可知,纳米氧化锌对损伤接种T.roseum、F.sulphureum和A.alternate的甜瓜病斑直径均具有一定的抑制作用。如第11 d时,浓度为3.00、6.00、9.00 mg/mL的液相纳米氧化锌处理由T.roseum损伤接种甜瓜果实时,其病斑直径分别为对照的71.7%、69.8%、67.9%。而液相纳米氧化锌对损伤接种F.sulphureum甜瓜果实的12 d病斑直径的影响中,浓度为3.00、6.00、9.00 mg/mL时分别是对照的85.3%、80.0%、72.0%。值得注意的是,浓度为3.00 mg/mL和6.00 mg/mL液相纳米氧化锌对损伤接种A.alternate甜瓜果实病害的抑制率表现出较好的抑制效果,然而当浓度增大为9.00 mg/mL,病斑直径反而增大,与对照之间无显著差异;另随着时间的增长,纳米氧化锌的作用呈现减弱趋势,如在第12 d时损伤接种F.sulphureum甜瓜病斑出现重叠,故三种菌的测定终点分别为13、12、30 d。

固相纳米氧化锌对损伤接种T.roseum甜瓜果实的9 d病斑直径影响中,浓度为0.30、0.60、0.90 mg/mL时,甜瓜病斑直径分别为对照的88.6%、86.4%、61.4%。而0.30、0.60、0.90 mg/mL的固相纳米氧化锌处理F.sulphureum损伤接种11 d的甜瓜果实时,病斑直径分别是对照的92.8%、85.5%、76.8%。而当浓度为0.30 mg/mL和0.60 mg/mL固相纳米氧化锌对损伤接种A.alternate甜瓜果实病害的抑制率表现出较好的抑制效果,然而,当浓度增大为0.90 mg/mL时病斑直径反而增大,与对照之间差异不显著。

3 讨论

体外实验中,纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum、A.alternate均具有明显的抑制作用,且在一定浓度范围内,随着纳米氧化锌浓度的增大,其抑制效果增强。这与何临海等[15]报道结果类似,该报道表明:不同质量浓度的纳米氧化锌悬浊液可显著抑制白色念珠菌的生长,且在一定浓度范围内,随着浓度的增大抑菌效果增强。

固相纳米氧化锌较液相纳米氧化锌对所研究病原菌的抑制效果更强,其原因可能是固相纳米氧化锌较液相纳米氧化锌颗粒小、粒度均匀,故比表面积亦相应较大,进而与实验菌的接触面积较大,产生的活性氧更易抵达实验菌表面,引起实验菌细胞膜的渗漏及细胞内大分子物质的变性,这与吕中等[7]研究表明不同形貌的纳米氧化锌对金黄色葡萄球菌均有较好的抗菌活性,且棱柱状的纳米氧化锌相对于其他两个形貌的纳米氧化锌抗菌活性更强,朱志红等[9]研究证实颗粒大小均匀、结晶性良好、晶型比较完整的纳米氧化锌具有良好的抑菌性能相一致。

同一状态的纳米氧化锌对不同菌的抑制效果不同,其中对T.roseum的抑制效果最强,其次是F.sulphureum,最后为A.alternate。其原因:一方面可能是由于这三种菌对纳米氧化锌敏感程度不同,T.roseum对纳米氧化锌最为敏感,然后依次是F.sulphureum,A.alternate。如He等[15]研究发现P.expansum比Botrytis cinerea对纳米氧化锌更为敏感。另一方面可能是同一纳米氧化锌对这三种菌的抑制作用方式不同:对A.alternate,可能是纳米氧化锌引起了菌丝的变形,在变形的菌丝细胞中过度积累了核酸和糖,进而干扰细胞代谢,从而抑制了该菌的活性;对T.roseum、F.sulphureum可能是由于纳米氧化锌引起了活性氧(ROS)浓度的增大,活性氧(ROS)与细胞膜接触并进入细胞,进而抑制病原菌的生长。He等[15]还发现纳米氧化锌主要是通过抑制分生孢子梗和分生孢子的生长来抑制P.expansum的

表4 纳米氧化锌对甜瓜病斑直径的影响Table 4 Effect of zinc oxide nanoparticles on the melon disease spot diameter

生长,但纳米氧化锌对B.cinerea的影响主要是通过干扰细胞功能及影响菌丝变形来对其进行抑制;此外,Elumalai等[16]研究发现,纳米氧化锌对Candida albicans和Candida tropicalis的的抑菌作用与H2O2浓度相关,随着纳米氧化锌浓度的增大,H2O2浓度在增大,其抑菌效果在增强。然而,关于纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum、A.alternate三种菌的作用机理仍需进一步探讨研究。

体内实验中,纳米氧化锌对由T.roseum、F.sulphureum、A.alternate分别引起的甜瓜粉霉病、白霉病、黑斑病均具有明显的抑制作用,可能是因为纳米氧化锌直接抑制了T.roseum、F.sulphureum、A.alternate的孢子萌发,进而减缓了菌丝的生长,即纳米氧化锌对这三种病原菌的生长活性具有直接的抑制作用,最后导致粉霉病、白霉病、黑斑病病害的减轻,这与刘瑾瑾等[11]证实的纳米氧化锌对由A.alternate、P.expansum分别引起的苹果黑斑病、青霉病有直接抑制作用相一致。

4 结论

两种状态纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum、A.alternate菌丝生长、孢子萌发均具有明显的抑制作用,且在一定浓度范围内随着浓度的增大抑制作用增强。不同状态的纳米氧化锌对T.roseum、F.sulphureum、A.alternate的抑制效果不同,其中固相纳米氧化锌较液相纳米氧化锌抑制效果强。同一状态的纳米氧化锌对不同菌的抑制效果不同,其中对T.roseum的抑制效果最强,其次是F.sulphureum,最后为A.alternate。纳米氧化锌对损伤接种T.roseum,F.sulphureum,A.alternate甜瓜病斑直径均具有明显的抑制作用。

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The inhibitory effects of zinc oxide nanoparticles treatment on the important pathogenic fungi causing postharvest disease in muskmelon

WANG Hu-jun1,2,LU jun1,XUE Hua-li1,2,3,*,ZHAO Jun1,*,BI Yang3,NAN Mi-na1,2
(1.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Agricultural Resources Chemistry and Application,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;3.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

To study the inhibitory effects of the zinc oxide nanoparticles on T.roseum,Fusarium spp.,Alternaria,which caused pink rot,Fusarium rot,black spot of postharvest muskmelon,respectively.The solid phase and liquid phase zinc oxide nanoparticles at different concentration and T.roseum,F.Sulphureum,A.alternate were used in vitro and vivo study.In vitro,the results showed that the significant inhibitory effect on mycelial growth and spore germination was found at different states of zinc oxide nanoparticles.The inhibition effect was greatly enhanced with the increase of the zinc oxide nanoparticles’s concentration.The inhibitory effect of the solid phase zinc oxide nanoparticles was more effective than the liquid phase one,which showed the most effect for T.roseum,then F.sulphureum,A.alternate.In vivo,it indicated that the solid phase and liquid phase zinc oxide nanoparticles had the significant inhibitory effect on the diameter of melon disease spot,which was caused by T.roseum,F.sulphureum,A.alternate,respectively.So zinc oxide nanoparticles could directly inhibit the major of pathogens to decrease disease of postharvest muskmelon,besides the inhibitory effect of solid phase zinc oxide nanoparticles was better than the liquid.

zinc oxide nanoparticles;Trichothecium roseum;Fusarium sulphureum;Alternaria alternate;antifungal

TS201.1

A

1002-0306(2016)04-0356-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.063

2015-05-26

王虎军(1991-),男,硕士研究生,研究方向:粮食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:feixuetiancan@sina.cn。

薛华丽(1977-),女,博士,研究方向:粮食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:xuehuali77@sina.com。赵军(1963-),女,硕士,研究方向:粮食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:zhaojun63@gsau.edu.cn。

公益性行业(农业)科研专项(201303075);甘肃省高等学校科研项目和甘肃农业大学伏羲人才青年基金项目。

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