中心复合设计法优化-气相色谱-质谱法检测奶粉中壬基酚

张方圆，林　晨，吴凌涛，王李平，蔡大川，张志军，方　丽（中国广州分析测试中心，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州510070）

中心复合设计法优化-气相色谱-质谱法检测奶粉中壬基酚

张方圆，林晨，吴凌涛，王李平*，蔡大川，张志军，方丽
（中国广州分析测试中心，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州510070）

目的：建立气相色谱-质谱法测定奶粉中壬基酚的分析方法。方法：先通过对比实验选择合适的萃取剂和净化小柱，再以色谱峰面积为响应值，采用中心复合设计对壬基酚的衍生化温度，衍生试剂量和衍生化时间进行优化，采用气相色谱-质谱法进行测定。结果：选择乙腈为蛋白沉淀剂和萃取剂，Florisil柱为固相萃取柱，N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（1%三甲基氯硅烷）为衍生试剂；当反应温度72℃，衍生试剂量为215 μL，反应时间为27 min，壬基酚的衍生效果最佳。在此优化条件下，壬基酚浓度范围为10.70～1369 ng/mL时，其线性良好，检出限为24.0 μg/kg，回收率为90.6%～105.2%，RSD为2.7%。结论：该方法准确、灵敏、基质干扰小，适用于奶粉中壬基酚的测定。

气相色谱-质谱法，中心复合设计，壬基酚，奶粉

壬基酚（Nonylphenol）是非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚的生物代谢产物，是一种典型的环境内分泌干扰物，具有雌激素活性，能够干扰动物体内激素的合成、释放、运输、代谢及功能的表达等一系列生物过程，从而协同或拮抗天然内源性内分泌激素的作用［1］。壬基酚广泛用于塑料增塑剂、纺织整理剂、工业和家用洗涤剂、农药和印染乳化剂等。壬基酚等环境激素广泛用于塑料增塑剂、纺织整理剂、工业和家用洗涤剂、农药和印染乳化剂等，很容易通过食物链进入动植物人体，在生物体内积累。奶粉中，由于其动物性奶源中可能会有壬基酚等雌激素的存在或是生产和包装过程中受到壬基酚的污染，而存在被壬基酚污染的可能性。这类环境激素进入人体，在机体内积累，对生殖能力造成严重影响，如性早熟、免疫力低下等，危害人们的身体健康［2］，现在已经引起社会的关注和重视。

目前报道的壬基酚的检测方法主要有气相色谱-质谱法（GC-MS），高效液相色谱法（HPLC）以及液相色谱-质谱法（HPLC-MS）。GC-MS因其较高的灵敏度和选择性，被广泛应用于环境样品中烷基酚的检测［3-5］。而有关奶与奶制品中壬基酚的检测方法的报道则较少。随着三聚氰胺事件的发生，奶与奶制品的质量安全问题引起了人们广泛的关注，奶与奶制品壬基酚等雌激素的存在或污染危害人们的身体健康，而我国尚无奶粉中壬基酚残留量的限量标准。因此，严格控制奶制品中壬基酚污染或添加，建立可靠、有效和完善的检验方法是非常必要的。

GC-MS虽然对烷基酚有良好的灵敏度和选择性，由于壬基酚属极性有机物，影响了GC-MS的灵敏度［6］，而衍生化后其灵敏度有明显的提高［7］，但是衍生化反应往往效果不好，且重现性较差［8］。中心复合设计（Central Composite Designs，CCDs），是近年来应用较多的一种改进和优化产品或实验设计的一种重要方法［9］。它是由2k因子设计、轴点设计与零水平的中心点重复实验三部分构成，可用非线性数学模型进行拟合，具有设计简单、实验次数少、预测性好等优点［10］。因此，本文建立GC-MS法测定奶粉中壬基酚的分析方法，针对奶粉样品的特点，对影响壬基酚萃取效率的因素进行分析，采用中心复合实验设计对壬基酚的衍生条件进行优化，并应用于奶粉样品的测定，以期为奶粉中壬基酚建立适用、可靠的检测方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

壬基酚混合标准品（Dr.Ehrenstorfer GmbH 99%）

用甲醇配成标准贮备液（2.14 mg/mL），于-4℃冰箱保存，临用前用乙醇逐级稀释成应用液；N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA） 上海阿拉丁试剂有限公司；三甲基氯硅烷（TMCS） 上海阿拉丁试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

Aglient7890A-5975C气质联用仪美国安捷伦公司；毛细管色谱柱：DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；固相萃取柱（SPE柱）北京迪马科技有限公司，1000 mg/6 mL；电热鼓风干燥箱上海一恒科技仪器有限公司；KQ-600E超声波清洗仪昆山超声仪器有限公司；TD25-WS多管架自动平衡离心机湖南赛特湘仪；氮吹仪Organomation Associates，Jnc.；XW-80A旋涡混合器上海琪特分析仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1萃取剂的选择平行称取4份奶粉样品于50 mL离心管中，均加入壬基酚标准液（2.14 μg/mL）1 mL，分别用乙腈、二氯甲烷、甲醇和1%三氯乙酸作提取剂。加入20.0 mL提取剂涡旋混匀，超声提取20 min，离心（3500 r/min）4 min，收集上清液。取5.0 mL上清液过经活化处理的Florisil柱，用5.0 mL蒸馏水淋洗，10.0 mL正己烷洗脱，收集洗脱液于10 mL比色管中，在氮气流下缓慢吹干。加入200 μL BSTFA （1%TMCS），用丙酮定容0.5 mL，70℃反应30 min，备分析用。

1.2.2净化柱的选择平行称取4份奶粉样品于50 mL离心管中，均加入壬基酚标准液（2.14 μg/mL）1 mL，加入20.0 mL乙腈涡旋混匀，超声提取20 min，离心（3500 r/min）4 min，收集上清液。各取5.0 mL上清液过经活化处理的Florisil柱、Silica柱、C18柱和阳离子交换柱，用5.0 mL蒸馏水淋洗，10.0 mL正己烷洗脱，收集洗脱液于10 mL比色管中，在氮气流下缓慢吹干。加入200 μL BSTFA（1%TMCS），用丙酮定容至0.5 mL，70℃反应30 min，备分析用。

1.2.3壬基酚测定方法的确定

1.2.3.1壬基酚的衍生化流程分别取1 mL壬基酚标准液（2.14 μg/mL）于10 mL比色管中，氮气吹干，加入BSTFA（1%TMCS），用丙酮定容至0.5 mL，恒温反应备分析用。

1.2.3.2中心复合实验设计根据中心复合设计的原理，采用3因素3水平的响应曲面分析方法。通过分析和综合文献对壬基酚硅烷化衍生的单因素实验，选取影响壬基酚衍生效果的3个主要因素：衍生温度、衍生试剂用量和衍生时间进行响应面优化实验设计，确定了各因素水平范围，因素水平见表1［3，5，11］。

表1　壬基酚衍生化因素水平Table 1　The factors and levels of the derivatization of nonylpbenol

1.2.4壬基酚的测定称取2.0 g奶粉于50 mL离心管中，加入20.0 mL乙腈涡旋混匀，超声提取20 min，离心（3500 r/min）4 min，收集上清液。取5.0 mL上清液过经活化处理的SPE柱，用5.0 mL蒸馏水淋洗，10.0 mL正己烷洗脱，收集洗脱液于10 mL比色管中，在氮气流下，加入215 μL BSTFA（1%TMCS），用丙酮定容0.5 mL，恒温72℃，反应27 min，备分析用。

1.3仪器工作参数

GC条件：以He为载气，恒流流速1.0 mL/min，进样口温度280℃；升温程序：初始温度为60℃，保持2 min，然后以15℃/min升至260℃，保持5 min。脉冲不分流进样，进样体积1.0 μL。

MS条件：接口温度280℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，EI源，电子轰击能量70 eV；信号采集方式为全扫描（Scan，30～350amu）和选择离子扫描（SIM）（m/z 179、193、221、292）。

1.4数据处理

采用Design Expert 8.0.5软件对中心复合设计的数据进行分析。

2　结果与讨论

2.1样品前处理的条件选择与优化

2.1.1萃取剂的选择奶粉样品中成分较复杂，基质干扰较大，其中蛋白质的沉淀和待测组分的提取是样品前处理的关键。通过对比实验，结果表明壬基酚在1%三氯乙酸中几乎不溶；二氯甲烷回收率较低；甲醇沉淀蛋白效果较差；而乙腈提取，既能很好的沉淀蛋白，且回收率满足分析要求。因此方法采用乙腈作为萃取剂。

2.1.2净化柱的选择采用固相萃取柱进行样品前处理时，不同SPE柱的萃取效率和吸附保留容量、不同洗脱剂和用量都会影响待测组分的提取和富集效率，按“1.2.2”方法进行实验，结果见图1。由图1可知，Florisil柱的效果最佳，当以正己烷为洗脱剂，洗脱量为10 mL时，回收率可达98%。正相固相萃取是动物源性食品中痕量组分富集净化常用的方法，对比Florisil柱净化前后的奶粉样品色谱图（图2），发现Florisil柱能够较好的去除奶粉中基质的干扰，达到净化目的。故选用Florisil柱对奶粉中的壬基酚进行净化和富集。

图1　不同SPE柱对壬基酚的回收率Fig.1　Recoveries of nonylpbenol with different solid-phase extraction cartridges

图2　奶粉样品经Florisil柱净化前后的色谱图Fig.2　The chromatogram of milk powder sample before and after solid-phase extraction with florisil extraction cartridge

2.2中心复合设计优化壬基酚衍生化条件

由于壬基酚的极性大且沸点高，故采用硅烷化衍生，将其转化为沸点更低的物质，再进行GC-MS测定，以获得更高的灵敏度。

采用中心复合设计对壬基酚的衍生条件进行优化，实验设计和结果见表2。

表2　实验设计与实验结果Table 2　Experimental arangements of central composite design and the corresponding response

利用Design Expert 8.0.5对表2的数据进行二次多元回归拟合，得到响应值对3个因素的多元回归方程：

Y=11911.88+1299.71A+973.01B+1081.72C-1408.38AB+267.84AC-1356.13BC-1808.45A2-1224.20B2-590.28C2

对响应面数据进行方差分析（表3），可得该模型“Prof＞F”=0.0411＜0.05，说明此模型差异显著；失拟项“Prof＞F”=0.126＞0.05，失拟项不显著，说明模型在整个回归区域的拟合度良好，模型建立合理。

表3　回归方程方差分析Table 3　ANOVA for the response surface quadratic regression model

为了进一步研究衍生温度，衍生试剂用量和衍生时间的交互作用对响应值的影响，绘制了相应的三维响应曲面图（图3）。响应图可以直观反映两两因素对响应值的影响，衍生效果随着其中两因素的增大先上升，当达到一定水平时，衍生效果上升缓慢，随后下降。响应曲面倾斜度越大说明交互作用越大，因素对反应的影响较为显著，实验结果表明，反应温度（A）和衍生试剂用量（B）对此衍生反应的影响较明显。

图3　壬基酚衍生效果的响应曲面图Fig.3　The response surfaces of derivatization of nonylpbenol with the three factors

通过对回归方程进行求导，可得极值点的坐标A=71.71，B=215.49，C=26.79，此时模型取得最优解39484.7。因实验操作过程中，对实验条件精准性的控制，将优化得到的反应条件修正为：反应温度为72℃，衍生试剂量为215 μL，反应时间为27 min。为了验证模型预测的准确性，按修正后的实验条件进行了6次验证实验，所得的平均响应值为38856（RSD= 4.1%），与预测值非常接近，表明此优化方法可行。

2.3色谱行为考察和评价

2.3.1线性范围和检出限按上述优化的衍生条件衍生后，进行GC-MS测定。壬基酚衍生化结构失去-C8H17，主要离子为179（m/z）和292（m/z）［12］，因此，选取179、193、221、292为特征离子，进行选择离子扫描，得到衍生后壬基酚的选择离子流图如图4所示，总共分离出12种同分异构体，其中主要同分异构体有9种，本文中把所有同分异构体作为总体进行定量分析。

图4　壬基酚的选择离子流图Fig.4　Selective ion chromatograms of nonylpbenol

分别移取50、100、200、800、1600、3200、6400 μL壬基酚标准溶液（0.214 μg/mL），于10 mL比色管，氮气吹干，按优化后的衍生条件衍生后，按照仪器工作条件对每个样品平行测定三次，取平均值，与对应的浓度进行线性拟合，得到壬基酚标准工作曲线。结果表明壬基酚在10.70～1369 ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，其线性方程为：y=19.8x+221.9，线性相关系数为0.9995。通过加标实验确定壬基酚的仪器检出限为24.0 ng/mL（S/N=3）。当样品取样量为2.0 g，定容体积为0.5 mL，稀释倍数为4，则壬基酚的检出限为24.0 μg/kg。

2.3.2方法准确度和精密度取3份相同样品作空白，另取同一样品做三水平加标回收实验。分别加入0.5、1.0和2.0 mL壬基酚标准溶液（0.214 μg/mL），按“1.2.4”方法提取、净化、衍生和测定，每一水平每个样品平行测定6次，计算加标回收率。奶粉中壬基酚的回收率为90.6%～105.2%，其标准相对偏差（RSD）为2.7%，满足分析测定的要求。

图5　空白、标样和样品色谱图Fig.5　The chromatogram of blank，nonylpbenol，and sample under the same conditions

2.3.3样品分析分别取市售的6份奶粉按上述方法进行壬基酚含量的测定，色谱图见图5。从图5可知，按“1.2.4”方法处理后，样品的基质效应较小，无明显干扰，其中3份样品未检出，另3份样品中均检出壬基酚，其含量分别为328、201和178 μg/kg。

3　结论

建立了气相色谱-质谱法检测奶粉中壬基酚的分析方法。实验结果表明该方法的回收率和重现性均满足痕量分析的要求，对壬基酚的检出限为24.0 μg/kg。该方法操作简单，且能有效去除奶粉中复杂基质的干扰，应用于奶粉中壬基酚的检测，可以得到满意的结果。

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Determination of the nonylpbenol in milk powder by gas chromatography-mass spectrometry with the aid of central composite design

ZHANG Fang-yuan，LIN Chen，WU Ling-tao，WANG Li-ping*，CAI Da-chuan，ZHANG Zhi-jun，FANG Li
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals，China National Analytical Center，Guangzhou 510070，China）

Objective：An analytical method based on the gas chromatography-mass spectrometric had been developed for the determination of nonylpbenol in milk powder.Method：Firstly，selecting the appropriate extraction and purification cartridge by the contrast experiment，then，by using the chromatographic peak area as response values，the temperature，time and the dosage of silylation reagent involved in the derivatization procedure were optimized by central composite design.Results：Acetonitrile was used as extractant and protein precipitator，the solid-phase extraction was conducted on a florisil extraction cartridge，and the silylation reagent was trimethyl chlorosilance with 1%trimethyl chlorosilane.Under the temperature of 72℃，with the dosage of silylation reagent of 215 μL，after a reaction time of 27 min，the derivatization of nonylpbenol reach the best result. Conclusions：Under the optimal conditions，the limit detection of nonylpbenol was 24.0 μg/kg，linearity range was 10.70～1369 ng/mL，and the recoveries ranged from 90.6%to 105.2%with a relative standard deviations of 2.7%.This method is accurate，sensitive，with small sample matrix interference，and applicable to the determination of nonylpbenol in milk powder.

gas chromatography-mass spectrometry；central composite design；nonylpbenol；milk powder

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0102-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.011

2015-05-25

张方圆（1989-），女，硕士，主要从事食品安全与质量控制方面的研究，E-mail：zhangfyde@163.com。

王李平（1985-），男，硕士，主要从事食品及药品的安全质量方面的研究，E-mail：wangjiang0916@126.com。

广东省专业镇中小微企业服务平台建设项目（2013B091604003）；广东省主体科研机构创新能力建设专项（粤科规财字【2014】208号）。