牛血清白蛋白-5-磺基水杨酸体系的荧光共振能量转移研究

1　实验

1.1试剂与仪器

SSA，美国Fluka公司，以二次蒸馏水配制成原溶液，使用时适当稀释；BSA(全组分)，美国Sigma公司，直接溶解于二次蒸馏水中配成原溶液；三羟甲基氨基甲烷(Tris，含量≥99%)，上海化学试剂公司分装厂，配制成pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液；NaCl(分析纯)，上海化学试剂公司，以二次蒸馏水配制成浓度为0.5mol·L-1的NaCl溶液。所有原溶液均于0～4 ℃暗处储存。

F-4600型荧光光谱仪(配置150W氙灯和恒温水浴槽)、U-3310型紫外可见分光光度计，日本日立公司。

1.2方法

1.2.1BSA-SSA体系的配制

取一定量的BSA和SSA溶液、2.0mLTris-HCl缓冲溶液、2.0mLNaCl溶液置于10mL比色管中，用二次蒸馏水稀释至10mL，搅拌均匀，即得BSA-SSA体系。

1.2.2BSA-SSA体系的光谱测定

荧光发射光谱于恒温294 K测定，激发波长280 nm，激发和发射狭缝宽度均为2.5 nm，扫描速度 1 200 nm·min-1；紫外吸收光谱于室温测定，狭缝宽度2 nm。

2　结果与讨论

2.1BSA-SSA体系的荧光发射光谱

荧光猝灭是指荧光量子产率降低(即荧光强度减弱)。不同的分子间相互作用均可导致荧光猝灭，包括分子重排、能量转移、基态复合物形成、碰撞猝灭等[11]。

固定BSA浓度、改变SSA浓度，研究SSA对BSA荧光发射光谱的影响，结果见图1。

cBSA=8.96×10-6 mol·L-1　a～e，cSSA(×10-6 mol·L-1)：0、0.41、0.83、1.24、1.65

由图1可知，当λex=280 nm时，BSA在338 nm处有强荧光峰，主要由色氨酸残基引起；随SSA浓度的增大，BSA位于338 nm处的荧光峰强度逐渐减弱，401 nm处的荧光峰强度逐渐增强。表明SSA对BSA的荧光具有猝灭作用。另外，随SSA浓度的增大，BSA荧光发射峰发生蓝移，表明荧光猝灭可能是由BSA与SSA形成复合物引起的[12]。

2.2BSA-SSA体系的紫外吸收光谱

固定BSA浓度、改变SSA浓度，研究SSA对BSA紫外吸收光谱的影响，结果见图2。

cBSA=9.07×10-6 mol·L-1　a～e，cSSA(×10-5 mol·L-1)：0、2.06、4.12、6.18、8.24

由图2可知，随SSA浓度的增大，BSA位于278.5 nm处的最大吸收峰发生红移，且吸收峰强度逐渐增强。表明BSA与SSA形成了复合物[13]。

2.3BSA-SSA体系的荧光共振能量转移

荧光共振能量转移(FRET)可分为辐射能量转移和非辐射能量转移，供体分子荧光发射光谱发生畸变时发生辐射能量转移。由2.1可知，SSA可有效猝灭BSA的荧光，说明BSA-SSA体系存在能量转移。当加入SSA时，BSA荧光发射光谱并未发生畸变，可认为BSA-SSA体系的荧光共振能量转移属于非辐射能量转移。根据Förster非辐射能量转移原理[14]，发生能量转移必须满足以下条件：(1)供体可发射荧光；(2)供体分子的荧光发射光谱与受体分子的紫外吸收光谱有足够的重叠；(3)供体与受体足够接近，最大距离不超过7 nm。

非辐射能量转移效率(E)、供体和受体之间距离(r)与临界能量转移(E=50%)距离(R0)的关系[14]如下：

(1)

(2)

(3)

式中：F、F0分别为有无猝灭剂时供体的荧光强度；K2为偶极空间取向因子，取供体和受体各向随机分布的平均值2/3；n为介质折射系数，一般取水和有机物折射指数的平均值1.336；φ为供体荧光量子产率，对于BSA为0.13[15]；J为供体荧光发射光谱与受体紫外吸收光谱的重叠积分(图3)；F(λ)为供体在波长为λ处的荧光强度；ε(λ)为受体在波长λ处的摩尔吸光系数。

cBSA=8.96×10-6 mol·L-1　cSSA=5.16×10-5 mol·L-1

根据式(1)～(3)，可计算得到以下参数：J=7.67×10-16cm3·L·mol-1，R0=1.52 nm，E=0.0573，r=2.42 nm。BSA的内源性荧光主要由色氨酸残基引起。BSA分子含有2个色氨酸残基，Trp-212残基位于子域ⅡA，而Trp-134残基位于子域ⅠB。Trp-134残基不易与水溶性配体接近，因此SSA仅与Trp-212残基相互作用，其相互作用距离为2.42 nm。供体和受体之间距离r<7 nm且0.5R0

3　结论

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Fluorescence Resonance Energy Transfer of Bovine Serum Albumin-5-Sulfosalicyclic Acid System

ZHANG Juan,LIU Jian-ping,ZHU Yan-shu

(SchoolofBasicMedicalSciences,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Fluorescenceresonanceenergytransferofbovineserumalbumin(BSA)-5-sulfosalicyclicacid(SSA)systemwasstudiedbyfluorescenceemissionandUVabsorptionspectra.Resultsshowedthat,thefluorescenceemissionspectrumofBSAwasquenchedbyadditionofSSAsolutionandthefluorescenceemissionpeakofBSAemergedablueshift,butthepeakshapeofBSAfluorescencespectrumwasunchanged.ThemaximumUVabsorptionpeakofBSAemergedaredshiftanditsabsorbanceintensityincreasedobviouslywiththeincreasingofSSAconcentration.AccordingtoFörstertheoryofnon-radiationenergytransfer,thedistancebetweenthedonor(BSA)andtheacceptor(SSA)inBSA-SSAsystemwascalculatedas2.42nm.

bovineserumalbumin(BSA);5-sulfosalicyclicacid(SSA);fluorescencequenching;energytransfer

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.010

宁夏卫生计生委(宁夏卫生厅)科研项目(2012051)

2016-03-24

张娟(1976-)，女，宁夏银川人，副教授，研究方向：电化学及光化学，E-mail:zhangjuano13@126.com。

O 657.39

1672-5425(2016)08-0042-03

张娟，刘建平，朱彦姝.牛血清白蛋白-5-磺基水杨酸体系的荧光共振能量转移研究[J].化学与生物工程，2016，33(8)：42-44.