SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化*

牛广华，张　程，吕　丹，高玉洁

(辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032)



SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化*

牛广华，张程△，吕丹，高玉洁

(辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032)

目的克隆人SSA/Ro60自身抗原并表达纯化，为辅助诊断自身免疫提供物质基础。方法采用RT-PCR技术扩增SSA/Ro60基因，定向插入pPICZ表达载体，转入毕赤酵母表达系统，将获得的重组蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果扩增出约1.5 kb的SSA/Ro60全长序列，获得相对分子质量60×103的重组蛋白，经鉴定具有SSA/Ro60抗原性。结论成功克隆并表达SSA/Ro60，为诊断自身免疫疾病奠定基础。

SSA/Ro60;基因克隆;表达纯化

干燥综合征(SS)是一种全身外分泌腺的慢性炎性自身免疫反应疾病。研究表明，干燥综合征A型抗原(SSA)与SS、系统性红斑狼疮(SLE)等疾病的发生、发展及预后判断密切相关[1]。SSA抗原是细胞质中一类小核糖核酸与蛋白质结合的复合物,是一种重要的自身抗原[2]。近年来越来越多的学者对自身免疫性疾病进行深入的研究，对Ro抗原的认识也越来越深，Ro成为了核糖核蛋白复合物(RNP)抗原中最常见的抗原之一[3]。后来发现，Ro抗原与SSA属同一种自身抗原，故命名SSA/Ro抗原[4]。同时有研究者发现检测SSA/Ro抗原在临床上对自身免疫性疾病的诊断有极其重要的意义[5]。该抗原有52 000和60 000两种相对分子质量的蛋白，分别称为SSA/Ro52和SSA/Ro60。SSA/Ro60存在于多种自身免疫性疾病患者体内,生理状态下SSA/Ro60核蛋白及hYRNA共同构成核糖核蛋白复合体SSA/Ro60抗原，与多种自身免疫疾病密切相关[6]。目前检测SSA的免疫双扩散法无法区分Ro52和Ro60，免疫印迹法只能检出Ro52，常常导致Ro60的漏检[5]。所以本实验应用基因克隆技术成功表达出SSA/Ro60，为下一步建立新的SSA/Ro60检测方法奠定基础。

1　材料与方法

1.1质粒、菌株、细胞株PMD18-T质粒、人白血病HL-60细胞株购买自TAKARA公司，pPICZ质粒、大肠埃希菌DH5α、酵母菌SMD1168由大连大学实验室赠送。

1.2仪器与试剂Thermo Hera生物安全柜；Biorad C1000 PCR扩增仪；Biorad稳压稳流水平电泳仪；Biorad稳压稳流垂直电泳仪；Thermo Heracell 150 CO2细胞培养箱；Thermo Maxq 6000恒温培养摇床；BIO-RAD凝胶成像分析系统；BIORAD电穿孔仪；电转化杯。PCR试剂盒、 DNA连接酶试剂盒、限制性内切酶、切胶纯化试剂盒、质粒抽提纯化试剂盒均购买自TAKARA公司。cDNA合成试剂盒来自Transgen Biotech。抗SSA抗体、生物素标记的羊抗鼠IgG、亲和素标记的HRP购买自ABCAM公司。

1.3方法

1.3.1SSA基因的扩增HL-60细胞株经CO2细胞培养箱培养收获，用TRIZOL方法提取RNA后反转录成cDNA。利用GeneBank数据库确定SSA在基因组的位置，设计其两端的引物，并引入限制性内切酶位点，HIS标签位点等为后续的克隆及蛋白纯化提供便利。上游引物：SAP3 5′-CCG GAA TTC AAA AGA ATG GAG GAA TCT GTA AAC CAA ATG CAG CCA CTG AAT GAG AAG CAG ATA-3′，下游引物：SAP4 5′-GCC TCG AGT TAT CAT TAT CAA TGA TGA TGA TGA TGA TGG GAA CCA CCA CCA CCT TAA ATC ATA TCT AAT GTG AAA TTT CGA ATT ACA T-3′。反应条件：94 ℃ 3 min， 94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s共30个循环， 72 ℃ 10 min。扩增片段应为1 511 bp。

1.3.2PCR产物纯化，TA克隆及测序将PCR产物切胶纯化后测量浓度，经合适的酶切后连接于PMD18-T载体构建重组质粒，通过蓝白斑筛选方法，挑出白色斑点的重组质粒进行LB培养，培养后送至上海生工测序。

1.3.3定向克隆将测序鉴定好的质粒和PICZ质粒进行双酶切，经切胶纯化后按合适浓度进行定向连接，转化至DH5α后过夜培养，提取质粒，酶切鉴定。

1.3.4重组子线性化、导入表达系统及筛选挑选正确的转化菌,增殖后抽提质粒,用SacⅠ行单酶切,生成线性pPICZ-SSA重组子。采用电穿孔方法,将线性重组子导入毕赤酵母菌SMD1168中。用G418筛选高表达重组菌。

1.3.5重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析在上述重组菌上清液1 mL加入0.4 g无菌的硫酸铵充分混匀,4 ℃条件下放置2 h,期间约10 min混匀一次,在4 ℃条件下,15 000 r/min离心5 min,弃上清液,加入15 μL pH 7.4 PBS彻底混匀,再加入上样缓冲液15 μL混匀,置100 ℃煮沸5 min(Marker煮1 min),然后4 ℃,15 000 r/min离心5 min。取25 μL样品加样后进行电泳(4 ℃,120 V),考马斯亮蓝染色。

1.3.6重组蛋白的Western blotting鉴定利用电转仪将重组蛋白转至PVDF膜上，BSA-TBST为封闭液，一抗是鼠抗人SSA抗体，二抗是生物素标记的羊抗鼠IgG抗体，在亲和素标记的HRP、TMB显色液共同作用下完成。

1.3.7蛋白纯化将离心过滤后的碎菌上清液加入准备好的His Bind column柱中，经过一系列的洗柱平衡后收集滤液。

2　结　　果

2.1SSA基因扩增及SSA-TA克隆测序琼脂糖凝胶电泳结果显示约一条1.5 kb的特异性条带,片段大小与预计的1 511 bp相符(图1)。且重组质粒测序结果显示与GeneBank报道的一致。

注：1为SSA PCR产物；M为DL2000 Marker。

2.2SSA-PICZ双酶切鉴定将SSA-PICZ重组质粒用XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切后电泳鉴定，得到两条清晰条带，片段大小分别为3.6 kbp和1.5 kbp，与预期结果一致(图2方框内)。

注：方框内为双酶切后基因片段，上面约3.6 kb为质粒，下面约1.5 kb为SSA;最右侧为DL2000 Marker。

2.3重组蛋白SDS-PAGE和Western blotting鉴定本实验成功表达出SSA/Ro60重组蛋白，经SDS-PAGE电泳分析，在60 000左右的位置出现一条较浓的蛋白区带(图3)。且该重组蛋白可与鼠抗人SSA结合，WB实验中可被特异性抗体识别，显示其有良好的特异性(图4)。

图3　　重组蛋白SDS-PAGE电泳图谱

图4　　重组蛋白Western blotting图谱

3　讨　　论

Ro抗原根据其蛋白成分相对分子质量的大小分为两种类型:Ro52和Ro60抗原[7]。Ro抗原大部分存在于细胞质内,少部分存在于核周质及核内。Ro抗原在细胞内以低含量的RNP形式存在,是与细胞角蛋白相似的一种纤维网络,所以对该抗原的提取具有一定的难度[8]。

由于自身抗原本身的特点为低含量、种类多,所以提取自身抗原的难度较大，要获得均一的自身抗原更为困难。本实验从人白血病淋巴细胞HL-60株提取RNA,通过反转录技术得到cDNA,再以cDNA为模板成功扩增出了SSA基因。将SSA基因转入pPICZ载体构建pPICZ-SSA重组质粒,并将重组质粒导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,最终获得纯度较高的重组蛋白，经过对重组蛋白的纯化鉴定后，证明其有一定的特异性。

本实验对靶基因SSA/Ro60 的核苷酸序列进行 cDNA 合成中,采取反转录PCR 这一途径代替用合成寡核苷酸探针筛选 cDNA 文库的繁琐基因克隆途径，可以方便、简捷地合成出目的基因SSA/Ro60。

毕赤酵母真核表达系统是蛋白表达研究中比较常用的表达系统。与原核表达系统相比,毕赤酵母基因系统具有许多优点[9-12]。(1)具有强大的启动子：毕赤酵母载体具有最强的醇氧化酶基因启动子，使得该表达系统对外源蛋白表达的调控相当严格。(2)表达量高：宿主菌株在毕赤酵母

菌中易于进行高密度连续发酵培养,外源蛋白表达量高。(3)稳定性高:重组质粒能在毕赤酵母体系中的特定位点以单/多拷贝的形式稳定整合,使外源基因在宿主细胞中稳定存在。

重组SSA/Ro60 抗原能特异识别患者体内抗SSA血清,因而可用重组抗原作为诊断抗原来检测自身免疫病,也可分析其片段的抗原性以了解其抗原表位，为探索自身免疫病的发生、发展提供辅助依据。下一步的研究中,笔者将对重组蛋白进行理化学分析，希望通过对SSA/Ro60重组抗原的透彻分析,从分子免疫学角度为某些自身免疫病的临床诊断提供依据，为制备重组抗原用于临床检测奠定基础。

[1]蔡逸婷，刘庆中，赵超，等.联合检测抗α-胞衬蛋白、抗SSA和抗SSB抗体在干燥综合征诊断中的应用[J].现代免疫学，2012，32(2)：152-155.

[2]彭勇， 谭立明，李华，等.ANA、SSA、SSB、RO-52在干燥综合征诊断中的临床意义 [J].实验与检验医学，2013，31(3)：229-247.

[3]郑宗富.SSA抗原的克隆表达及其抗体检测方法的建立[D].福州：福建医科大学学报，2007.

[4]魏权，杨湘越，兰小鹏．人自身抗原SSA/Ro60的基因克隆和原核表达[J]．实用医技杂志，2005，12(23)：3393-3394．

[5]徐泉.60kd SSA/Ro抗原的提取、纯化及蛋白质组学鉴定[D].北京：中国协和医科大学，2004.

[6]李洁.抗SSA/RO60kDa抗原表位特异性单克隆抗体的表达和致病机制的研究[D].北京：中国协和医科大学，2009.

[7]吕良敬，陈顺乐， 顾越英，等.R060/SSA基因转染HEp-2细胞作为间接免疫荧光检测底物及其应用[J].标记免疫分析与临床，2006，13(1)：31-34.

[8]朱涛.人自身抗原Ro52的酵母重组表达及其抗体检测斑点免疫金渗滤法的建立[D].福州：福建医科大学，2011.

[9]张义浜，施立楠，唱韶红，等.人sTNFRⅡ-IgG Fc融合蛋白在毕赤酵母菌中的表达及其产物分析[J].细胞与分子免疫学杂志，2007,23(6)：515-519.

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Gene cloning and expression purification of human autoimmune antigen SSA/60*

NIUGuanghua,ZHANGCheng△,LYUDan,GAOYujie

(AffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang,Liaoning110032,China)

ObjectiveTo clone human autoimmune antigen SSA/Ro60 and to purify its expression to provide the material basis for the assisted diagnosis of human autoimmune diseases.MethodsThe SSA/Ro60 gene was cloned by RT-PCR and directionally inserted into expression vector pPICZ.The recombinant plasmid was transformed into Pichia SMD1168.The obtained recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.ResultsThe amplified full-length sequence was about 1.5 kb in size.The pPICZ-SSA positive clone produced a 60×103recombinant protein which had natural immunogenicity of human autoimmune antigen SSA/Ro60 by SDS-PAGE and Western blot.ConclusionHuman autoimmune antigen SSA/Ro60 is successfully cloned and expressed,which lays a foundation for diagnosing autoimmune diseases.

SSA/60；gene cloning；expression and purification

辽宁省自然科学基金资助项目(02014010058-301)。

牛广华，男，主任技师，主要研究方向是风湿免疫分子生物。△

，E-mail:cecillia-85414@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.007

A

1673-4130(2016)16-2224-03

2016-01-29

2016-06-03)