响应面法优化微波辅助提取平卧菊三七三萜的工艺研究

叶芝红，赵 艳，朱艳萍，郑国栋（江西农业大学食品科学与工程学院江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌330045）

响应面法优化微波辅助提取平卧菊三七三萜的工艺研究

叶芝红，赵 艳，朱艳萍，郑国栋*
（江西农业大学食品科学与工程学院江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌330045）

本文研究了用微波辅助提取平卧菊三七三萜的工艺。考察乙醇浓度、微波时间、微波功率、提取温度和料液比等因素对平卧菊三七三萜提取得率的影响。在单因素实验基础上利用Box-Behnken实验设计方法和响应面分析法，确定其最佳提取工艺条件。实验结果表明，当乙醇浓度90%和微波功率600 W时，微波辅助提取平卧菊三七三萜的最佳提取条件为：微波时间8.6 min、提取温度57.7℃、料液比1∶33 g/mL。在此条件下平卧菊三七三萜的提取率为2.13%，与模型预测值2.14%之间具有良好的拟合性。

平卧菊三七，三萜，微波辅助提取，响应面优化

平卧菊三七（Gynura procumbens）是一种多年生菊科三七属植物，又名续命草、神仙草，生于林间溪旁坡地砂质土上，攀援于灌木或乔木上，主要分布于东南亚及我国南部和西南部地区［1］。2012年5月平卧菊三七被国家卫生部批准为新资源普通食品，近年来在江西省靖安、丰城和都昌等地通过无性繁殖等技术进行了大面积人工栽培，是一种比较容易开发和应用潜力很大的食物。三萜化合物多数是一类基本母核由30个碳原子组成的萜类化合物，其结构是由六个异戊二烯单体聚合而成。三萜化合物在自然界种类繁多，分布广泛，大多为四环三萜和五环三萜，少数有链状、单环和三环等结构［2］。三萜化合物具有抗癌、抑菌、抗肿瘤、降糖、降脂等广泛的生理活性［3-7］。

研究表明平卧菊三七含有丰富的黄酮类、多糖类、绿原酸、多不饱和脂肪酸等多种生物功能活性因子［8-10］，国内外药理研究表明其及其粗提物具有降压、降糖、降脂、抗菌等功效［11-14］。然而平卧菊三七提取三萜还未见报道，本研究以平卧菊三七为原料，采用响应面设计分析法对微波辅助提取三萜化合物工艺进行优化，以期获得较高的提取得率，为后续平卧菊三七活性物质的研究和利用提供实验基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

平卧菊三七 采自江西农业大学中药园，清洗晒干粉碎过60目筛；齐墩果酸标准品 成都曼思特生物科技有限公司；无水乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等试剂 均为分析纯级。

XH-100B电脑微波催化合成萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司；V5600型可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；TDL-5-A低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂；HH-60数显恒温磁力搅拌循环水箱 常州市国华电力仪表设备有限公司；JSP-200粉碎机 浙江省永康市金穗机制造厂；QT-2漩涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 齐墩果酸标准曲线的绘制 参照孟宪军［15］的方法。检测标准曲线的绘制过程如下：称取一定量的齐墩果酸标准品，用无水乙醇溶解后配成0.15 mg/mL的齐墩果酸标准溶液，精确吸取溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL，分别加入试管中，首先将所有试管置于水浴锅中加热挥尽乙醇溶剂，然后分别加入新制的5%香草醛-冰乙酸0.40 mL和高氯酸1.0 mL，利用涡流混合器迅速混匀后将试管置于60℃水浴中加热15 min，取出流水冷却至室温，加5.0 mL冰醋酸，迅速混匀溶液，静置15 min，在547 nm处测定吸光值，以吸光度为纵坐标，齐墩果酸质量为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 平卧菊三七三萜类化合物提取 称取平卧菊三七粉末1 g，加入一定浓度的乙醇溶液提取剂，在一定的温度、一定提取时间和一定的微波功率条件下进行微波辅助提取，将不同条件下处理得到的提取液进行离心（3500 r/min，15min），得到平卧菊三七三萜的待测液，每份样液分别取上清液0.20 mL置于试管中，在恒温水浴锅中沸水浴挥干溶剂，然后分别加入新制的5%香草醛-冰乙酸0.40 mL和高氯酸1.0 mL，利用涡流混合器迅速混匀后将试管置于60℃水浴中加热15 min，取出流水冷却至室温，加5.0 mL冰醋酸，迅速混匀溶液，静置15 min，在547 nm处测定吸光值，根据标准曲线计算平卧菊三七三萜的提取得率，计算公式如下：

1.2.3 单因素实验设计 以平卧菊三七三萜提取得率为指标，在固定其他实验条件的情况下，分别考察乙醇浓度、微波时间、微波功率、提取温度和料液比对三萜提取得率的影响。

1.2.3.1 乙醇浓度对平卧菊三七三萜提取得率的影响 按1.2.2的操作方法，在微波时间8 min，微波功率600 W，提取温度60℃，料液比1∶30 g/mL的条件下，分别考察乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%、95%对平卧菊三七三萜提取得率的影响。

1.2.3.2 微波时间对平卧菊三七三萜提取得率的影响 按1.2.2的操作方法，在乙醇浓度90%，微波功率600 W，提取温度60℃，料液比1∶30 g/mL的条件下，分别考察微波时间为2、4、6、8、10、12 min对平卧菊三七三萜提取得率的影响。

1.2.3.3 微波功率对平卧菊三七三萜提取得率的影响 按1.2.2的操作方法，在乙醇浓度90%，微波时间8 min，提取温度60℃，料液比1∶30 g/mL的条件下，分别考察微波功率为300、400、500、600、700、800 W对平卧菊三七三萜提取得率的影响。

1.2.3.4 提取温度对平卧菊三七三萜提取得率的影响 按1.2.2的操作方法，在乙醇浓度90%，微波时间8 min，微波功率600 W，料液比1∶30 g/mL的条件下，分别考察提取温度为30、40、50、60、70、80℃对平卧菊三七三萜提取得率的影响。

1.2.3.5 料液比对平卧菊三七三萜提取得率的影响

按1.2.2的操作方法，在乙醇浓度90%，微波时间8 min，微波功率600 W，提取温度60℃的条件下，分别考察料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL对平卧菊三七三萜提取得率的影响。

1.2.4 响应面法优化平卧菊三七三萜提取实验 在单因素实验的基础上优化实验条件，选择微波时间、提取温度和料液比为自变量，运用Design Expert 6.0.1软件按照Box-Behnken设计方法进行3因素3水平的响应曲面法分析，并对数据进行多项式回归分析，建立二次响应回归模型，拟合二次回归方程，得到微波辅助提取三萜的最佳工艺参数。实验设计方案见表1。

表1 响应曲面法实验因素水平编码表Table1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3 数据处理

单因素中均取3次平行实验的平均值进行分析作图，采用OriginPro 8.5软件作图；响应面优化实验的数据用Design-expert 6.0.1软件分析处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

齐墩果酸标准溶液中齐墩果酸的质量与吸光度拟合的回归方程：A=0.0083m+0.0057，R2=0.9993。结果表明，齐墩果酸在质量为0.015～0.105 mg时与其吸光度线性关系良好。

2.2 单因素实验结果分析

2.2.1 乙醇浓度对平卧菊三七三萜提取得率的影响

由图1可知，随着乙醇浓度的升高，三萜的提取得率逐渐增加后降低，当90%时，三萜得率最高，根据极性的相似相容原理，表明在90%的乙醇溶液极性是最适合提取，且提取效果最好。

2.2.2 微波时间对平卧菊三七三萜提取得率的影响

由图2可知，在微波时间2～8 min间，随着微波时间的延长三萜的提取得率增大；在8 min后，提取得率迅速下降。原因可能是当微波时间过长时，会造成三萜结构的破坏或者是其活性成分的损失因而造成三萜得率的下降［16］，因此选取的最佳微波时间8 min。

图1 乙醇浓度对平卧菊三七三萜提取得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

图2 微波时间对平卧菊三七三萜提取得率的影响Fig.2 Effect of microwave time on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.2.3 微波功率对平卧菊三七三萜提取得率的影响由图3可知，随着微波功率的升高，三萜的提取得率逐渐提高，当微波功率大于600 W后其上升的幅度较小，从提取效果和后续处理能耗等方面考虑，选取微波功率600 W为宜。

图3 微波功率对平卧菊三七三萜提取得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.2.4 提取温度对平卧菊三七三萜提取得率的影响

由图4可知，不同的提取温度对三萜提取得率的影响不同，三萜的提取得率随着温度的升高先增大后减小，当温度为60℃时提取得率最大。所以提取温度为60℃提取效果最好。

图4 提取温度对平卧菊三七三萜提取得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.2.5 料液比对平卧菊三七三萜提取得率的影响

由图5可知，三萜的提取得率随着料液比的增大呈现先增大后减小的趋势，在1∶30 g/mL时达到最大值，这主要是因为在一定范围内当溶液体积增大时，三萜溶解的更多。但是当溶剂含量过大时，溶剂对微波的能量吸收增加，导致细胞液对微波能量的吸收减少，造成细胞破壁不完全，细胞内容物质不能充分溶出，从而使其含量出现下降趋势。

图5 料液比对平卧菊三七三萜提取得率的影响Fig.5 Effect of different soild-liquid ratio on the yield of triterpenoids from Gynura procumbens

2.3 响应面法优化实验结果

2.3.1 建立模型 在单因素实验结果的基础上，根据Box-Behnken组合设计原理，以三萜提取得率为响应值（Y），利用Design Expert 6.0.1软件设计了3因素3水平的响应面实验，对三萜的提取条件进行优化，共进行17个实验点，其中包含12个析因点和5个零点实验，12个析因点实验用以考察微波时间、提取温度、料液比3个因素对微波提取三萜含量的影响是否显著，5次零点实验用作误差估计。实验设计和结果见表2。

2.3.2 方差分析与显著性检验 利用软件对实验结果进行二次多项式回归拟合，对表2的数据进行方差分析后得到模型的二次多项式回归方程如下：

表2 响应面实验设计方案与结果Table2 Test design and results of RSM

表3 方差分析与显著性检验Table3 The variance analysis and significance test

从表3回归方差分析结果表明，响应面的回归模型极显著（p＜0.0001）；模型的失拟项不显著（p= 0.4351＞0.05），说明该模型对本实验拟合较好。从表3还可以看出因素一次项X1、X2、X3和二次项X、X、X即微波时间、提取温度和料液比对实验结果的影响极显著（p＜0.05），而各因素交互项X1X2、X1X3、X2X3对实验结果的影响不显著（p＞0.05），即微波时间、提取温度和料液比之间交互作用不显著。

2.3.3 响应面分析与优化 根据回归方程绘制响应曲面图和等高线图，分析微波时间、提取温度和料液比等因素及其交互作用对微波辅助提取三萜得率的影响。结果见图6～图8。

图6 三萜提取得率=f（X1，X2）响应曲面图（X3=1∶30 g/mL）Fig.6 The yield of triterpenoids in Gynura procumbens=f（X1，X2）response surface plot（X3=1∶30 g/mL）

图7 三萜提取得率=f（X1，X3）响应曲面图（X2=60℃）Fig.7 The yield of triterpenoids in Gynura procumbens=f（X1，X3）tesponse surface plot（X2=60℃）

图8 三萜提取得率=f（X2，X3）响应曲面图及等高线图（X1=8 min）Fig.8 The yield of triterpenoids in Gynura procumbens=f（X2，X3）response surface plot（X1=8 min）

通过响应面的坡度陡峭程度和等高线图椭圆形状可以直观反映出两个因素交互作用的强弱程度，如果响应面坡度相对平缓说明因素间的交互效应弱，即当实验条件改变时其对响应值影响不大；反之，如果响应面坡度非常陡峭说明因素间的交互作用强，即当实验条件有变异时响应值会差异较大。等高线呈椭圆形表示两个因素交互作用显著，而等高线接近圆形表示交互作用不显著。故由图6～图8可知，微波时间和提取温度、微波时间和料液比以及提取温度和料液比的交互作用都不显著，与上述方差分析和显著性检验相符。

2.3.4 验证实验 通过Design Expert 6.0.1软件对优化后的回归方程分析，在各个实验因素水平范围内微波辅助提取三萜的最佳参数为：微波时间8.59 min、提取温度57.64℃、料液比1∶32.78 g/mL，在此最佳工艺条件下平卧菊三七三萜的最大提取得率为2.14%。

为了验证回归模型的有效性，结合实验所得的最佳工艺条件和实际操作的可行性，选择在微波时间8.6 min，提取温度57.7℃，料液比1∶33 g/mL的条件下，进行3次重复验证性实验，分别是2.13%、2.12%、2.14%，实际平均得率为2.13%，与预测值2.14%较接近。结果表明该模型是合理有效的，微波辅助提取有效的对三萜提取工艺进行了优化。

3 结论

本文在单因素实验结果的基础上以三萜的提取得率为衡量指标，采用响应面分析法研究微波辅助提取三萜的工艺参数，得到最佳工艺条件为微波时间8.6 min，提取温度57.7℃，料液比1∶33 g/mL，在此条件下平卧菊三七三萜的平均提取率为2.13%。

［1］中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，2010：322.

［2］瘐石山.三萜化学［M］.北京：化学工业出版社，2008.

［3］黄志勤，李洪亮，孙立波，等.齐墩果酸抗大鼠移植性肝癌作用的研究［J］.安徽农业科学，2011，39（18）：10807-10808，10851.

［4］张月红.青钱柳叶三萜类化合物提取纯化、分离鉴定及其抑菌活性研究［D］.南昌：江西农业大学，2012.

［5］Uto T，Ayana S，Nguyen HT，et al.Anti-Proliferative Activities and Apoptosis Induction by Triterpenes Derived from Eriobotrya japonica in Human Leukemia Cell Lines［J］.Int J Mol Sci，2013 （14）：4106-4120.

［6］Zong W，Zhao GY，An GJ，et al.Corosolic acid isolation from the leaves of Eriobotrta japonica showing the effects on carbohydrate metabolism and differentiation of 3T3-L1 adipocytes［J］.Asia Pac J Clin Nutr，2007，16（1）：346-352.

［7］Kim JY，Hong JH，Jung HK，et al.Grape skin and loquat leaf extracts and acai puree have potent anti-atherosclerotic and anti-diabetic activity in vitro and in vivo in hypercholesterolemic zebrafish［J］.Int J Mol Med，2012，30（3）：606-614.

［8］张颖，姜坤，杨利军，等.平卧菊三七叶化学成分的分离与鉴定［J］.沈阳药科大学学报，2012，29（5）：337-339.

［9］朱玉婷，廖为明，郑国栋，等.平卧菊三七中绿原酸提取及纯化工艺的优化［J］.湖北农业科学，2012，51（19）：4348-4351.

［10］董芳，竺梅，王英锋，等.平卧菊三七的脂肪酸成分分析［J］.首都师范大学学报：自然科学版，2012，33（5）：21-22，36.

［11］Akowuah GA，Sadikun A，Mariam A，et al.Flavonoid identification and hypoglycaemic studies of the butanol fractionfrom Gynura procumbens［J］.Pharm Biol，2002，40（6）：405-410.

［12］Zhang XF，Tan BK.Effects of an ethanolic extract of Gynura procumbens on serum glucose cholesterol and triglyceridelevels in normal and streptozotocin induced diabetic rats［J］.Singapore Med J，2000，41（1）：9-14.

［13］郑国栋，钟树生，张清峰，等.平卧菊三七对小鼠血糖及血脂的影响［J］.现代食品科技，2013，29（12）：2800-2804.

［14］郑国栋，帅丽乔娃，黎冬明，等.平卧菊三七提取及抗菌作用的研究［J］.食品科技，2014，39（4）：218-221.

［15］孟宪军，李斌，李元甦，等.响应面法优化微波辅助提取北五味子总三萜工艺［J］.食品与生物技术学报，2011，30（6）：20-24.

［16］曲建辉.安梨中三萜类化合物的分离提取与成分分析［D］.秦皇岛：河北科技师范学院，2014.

Optimization of microwave-assisted extraction of triterpenoids from Gynura procumbens by response surface methodology

YE Zhi-hong，ZHAO Yan，ZHU Yan-ping，ZHENG Guo-dong*
（Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food，College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

To optimize technological parameters for mircrowave-assisted extraction yield of total triterpenoids from Gynura procumbens.The experiments investigated the effects of extraction，such as ethanol concentration，extraction time，microwave power，temperature，and ratio of solid to liquid.Further，the experiments were optimized using a Box-Behnken method of test design and response surface methodology on the basis of the single factor experiment.When the ethanol concentration was 90%and microwave power was 600 W，the optimal extraction conditions were as follows:extraction time was 8.6 min，temperature was 57.7℃and ratio of solid to liquid was 1∶33 g/mL.Under these conditions，the extraction yield of total triterpenoids from Gynura procumbens was up to 2.13%，which was well matched with predicted yield 2.14%.

Gynura procumbens；triterpenoids；mircrowave-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2016）02-0291-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.050

2015－05－29

叶芝红（1990-），女，硕士研究生，研究方向：天然产物的分离提取，E-mail：18770051363@163.com。

*通讯作者：郑国栋（1969-），男，博士，副教授，研究方向：天然产物的分离提取和功能食品，E-mail：zrs150716@aliyun.com。

江西省研究生创新专项资金项目（YC2015-S198）。