假耧斗菜中化学成分的研究

王姣姣 吴 润 李嘉敏 黄 帅 周先礼西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都 610031

假耧斗菜中化学成分的研究

王姣姣 吴 润 李嘉敏 黄 帅 周先礼
西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都 610031

目的 研究假耧斗菜中的化学成分。 方法 运用多种方法对其化学成分进行纯化和鉴定，并运用3-（4，5-二甲基吡啶-2）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2-氢-四唑盐（MTS）比色法考察了化合物Ⅰ和Ⅱ的对肺癌细胞H460、人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞Hep G2的体外抗肿瘤活性。 结果 共分离得到7个化合物，分别为：Paraquinin A（Ⅰ）、Praquinin B（Ⅱ）、小檗碱（Ⅲ）、Menisdaurin（Ⅳ）、3，4-二甲基苯甲酸（Ⅴ）、对羟基苯甲酸（Ⅵ）、己内酰胺（Ⅶ），抗肿瘤活性结果显示化合物Ⅰ和Ⅱ均无细胞毒活性。 结论 化合物Ⅲ～Ⅶ为首次从该植物中分离得到，并首次测试了化合物Ⅰ和Ⅱ的抗肿瘤活性。

假耧斗菜；化学成分；碳苷；氰苷

假耧斗菜Paraquilegia microphylla（Royle）Drunmm.Et Hutch.为毛茛科的假耧斗菜属植物，主要分布于西藏、四川、甘肃、云南、青海等地。假耧斗菜为西藏常用中草药，具有镇痛、催产的功效［1］。假耧斗菜属植物中含有皂苷类、酚酸类、黄酮类化合物及生物碱类化合物［2-13］。前人从中分离得到3个黄酮碳苷［9］和2个三萜皂苷［10］。本研究进一步对其化学成分进行研究，得到7个化合物。见如图1。分别为Paraquinin A（Ⅰ）、Praquinin B （Ⅱ）、小檗碱 （Ⅲ）、Menisdaurin（Ⅳ）、3，4-二甲基苯甲酸 （Ⅴ）、对羟基苯甲酸（Ⅵ）和己内酰胺（Ⅶ）。化合物Ⅲ～Ⅶ为首次从该植物中分离得到。采用MTS比色法测试了化合物Ⅰ和Ⅱ对H460、MCF-7和Hep G2的体外抗肿瘤活性。

图1 假耧斗菜中分离得到的化合物

1 仪器与材料

核磁共振仪Varian NMR system 600，Waters 600

半制备型高效液相色谱仪，质谱仪Q-TOF micro mass spectrometer（Waters）型。色谱用硅胶G和H（青岛海洋化工厂产品），反相硅胶RP-18（Merck公司）。

药材于2012年4月由西藏自治区食品药品检验所提供，由西藏自治区食品药品检验所格桑索朗副主任药师鉴定为假耧斗菜。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

假耧斗菜地上部分5.5 kg，用95%乙醇冷浸提取3次，每次7 d，减压浓缩得到浸膏330 g。取300 g浸膏悬浮于50℃的热水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到石油醚浸膏A（100 g）、乙酸乙酯浸膏B（30 g）和剩余水部分C。

C部分经D-101大孔树脂柱色谱，分别用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脱得C1～C3；C1经硅胶柱色谱，乙酸乙酯∶甲醇（25∶1～0∶1）梯度洗脱分为C1-1～C1-5五部分，C1-1经反复硅胶柱层析得到化合物Ⅰ （158 mg），C1-2经反复硅胶柱层析得到化合物Ⅱ（221 mg）；C1-4经反复硅胶柱层析（乙酸乙酯∶甲醇15∶1）得到化合物Ⅲ（10 mg）；

B部分经硅胶柱层析 （石油醚∶乙酸乙酯=1∶0～0∶1）得到B1、B2、B3三部分；B2部分再经过反复硅胶柱层析（石油醚∶丙酮=8∶2），结合制备高效液相色谱，得化合物Ⅴ（25 mg）和Ⅵ（51 mg）。B2部分再经过反复硅胶柱层析（石油醚∶丙酮7∶3）得化合物Ⅶ（10 mg）。B3部分再经过反复硅胶柱层析（氯仿∶甲醇=9∶1），得化合物Ⅳ（23 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物Ⅰ：黄色粉末，HR-ESI-MS确定其分子式C28H32O15（m/z：609.1816［M+H］+，calcd.for C28H33O15，609.1819）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）：δ 6.98，6.98 （s，H-3），6.95，6.90（s，H-8），8.05（d，J=8.8，H-2'，H-6'），7.10（d，J=8.8，H-3'，H-5'），3.87（s，H-4'），13.49 （s，5-OH），13.50（s，5-OH），4.69（d，J=8.8，H-1''），4.84（d，J=8.8，H-1'''）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：163.8，163.6（C-2），103.9，103.8（C-3），182.5，182.2 （C-4），160.4，159.4（C-5），111.0，110.9（C-6），162.6，161.6（C-7），93.9，93.5（C-8），156.6，156.3（C-9），105.5，105.0（C-10），122.6（C-1'），128.5（C-2'，C-6'），114.7 （C-3'，C-5'），162.6（C-4'），55.7（4'-OCH3），71.0，70.9 （Glc-1''），79.0，78.9（Glc-2''），77.3，77.2（Glc-3''），70.2，69.6（Glc-4''），81.6，81.0 （Glc-5''），60.7，61.9 （Glc-6''），101.2，100.9（Glc-1'''），73.9，73.9（Glc-2'''），76.0，75.8（Glc-3'''），69.5，69.4（Glc-4'''），（Glc-5'''），60.4，60.6（Glc-6'''）。数据与文献［9］一致，故鉴定化合物Ⅰ为Acacetin-6-C-β-D-glucopyranosyl-（1→2）-β-D-glucopyranoside，俗名为Paraquinin A。

化合物Ⅱ：黄色粉末，HR-ESI-MS确定其分子式C34H42O19（m/z 755.2397［M+H］+，calcd.for C34H43O19，755.2399）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）：δ 6.99，6.96，（s，H-3），6.95，6.91（s，H-8），8.06（d，J=8.8，H-2'，H-6'），7.13（d，J=8.8，H-3'，H-5'），3.87（s，H-4'），13.49，13.50 （s，5-OH），4.75（d，J=8.8，H-1''），4.73（d，J=8.8，H-1''），4.72（d，J=8.8，H-1'''），4.71（d，J=8.8，H-1'''），4.96（s，H-1''''），4.97（s，H-1''''）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）：163.6，163.5（C-2），103.9，103.6（C-3），182.6，182.1（C-4），160.7，159.3（C-5），111.4，110.7（C-6），162.5，161.4（C-7），94.5，94.3（C-8），156.7，156.3（C-9），105.7，105.1（C-10），122.6（C-1'），128.5（C-2'，C-6'），114.7（C-3'，C-5'），162.8（C-4'），55.7（4'-OCH3），71.0，70.9（Glc-1''），71.0，70.6（Glc-2''），77.3，77.2（Glc-3''），70.1，69.7（Glc-4''），81.1，81.0（Glc-5''），60.9，61.8 （Glc-6''），102.0，101.1（Glc-1'''），76.8，74.9（Glc-2'''），73.8，73.3（Glc-3'''），69.8，69.5（Glc-4'''），76.4，75.9（Glc-5'''），60.3，60.5（Glc-6'''），100.6，100.5（Rha-1''''），71.2，71.1（Rha-2''''），70.5，70.3（Rha-3''''），72.1，71.6（Rha-4''''），68.4，68.1（Rha-5''''），17.7，17.6（Rha-6''''）。以上数据与文献［9］对照一致，故鉴定化合物Ⅱ为Acacetin-6-C-α-L-rhamnopyranosyl-（1→ 2）-β-D-glucopyranosyl-（1→2）-β-D-glucopyranoside，俗名为Paraquinin B。

化合物Ⅲ：黄色粉末，HR-ESI-MS确定其分子式C20H18NO4（m/z：336.1234［M+H］+，calcd.for C34H43O19，336.1236）［14］。与小檗碱对照品共薄层Rf值相同，故鉴定化合物Ⅲ为小檗碱。

化合物Ⅵ：无色固体。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：5.50（1H，s，α-H），6.29（1H，d，J=9.6 Hz，H-2），6.21（1H，dd，J=3.6，9.6 Hz，H-3），4.36（1H，m，H-4），2.25（1H，m，H-5α），2.02（1H，m，H-5β），4.93（1H，dd，J=16，8.4，H-6），4.55（1H，d，J=7.8，H-1'）。13C NMR （125 MHz，CD3OD）δ：96.8（C-α），157.1（C-1），127.7 （C-2），140.6（C-3），65.4（C-4），36.1（C-5），72.5（C-6），118.0（CN），101.5（C-1'），74.5（C-2'），78.0（C-3'），71.7（C-4'），78.1（C-5'），63.1（C-6'）。数据与文献［15］一致，故鉴定化合物Ⅵ为（4S，6R）-（Z）-6-（β-D-glucopyranosyloxy）-4-hydroxy-2-cyclohexene-1，α-acetonitrile，俗名为Menisdaurin。

化合物V：无色固体，HR-ESI-MS确定其分子式为 C7H6O4（m/z 139.0395［M+H］+，calcd.for C7H7O4，139.0395）。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.45（1H，br.s，H-1），6.79（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），7.43（1H，d，J= 8.4 Hz，H-6）。13C NMR（125 MHz，CD3OD）δ：169.8

（COOH），122.4（C-1），116.3（C-2），144.6（C-3），149.8 （C-4），114.2（C-5），122.4（C-6）。数据与文献［16］一致，故鉴定化合物Ⅴ为3，4-二羟基苯甲酸。

化合物Ⅵ：无色固体，HR-ESI-MS确定其分子式为 C7H6O3（m/z：153.0121［M-H］-，calcd.for C7H5O3153.0188）［17］。与对羟基苯甲酸对照品共薄层Rf值相同，故鉴定化合物Ⅵ为对羟基苯甲酸。

化合物Ⅶ：无色固体，分子式C6H11NO。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：2.19（2H，m，H-2），1.63（2H，m，H-3），1.35（2H，m，H-4），1.51（2H，m，H-5），3.16（2H，m，H-6）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：175.9（C-1），36.9（C-2），26.7（C-3），27.5（C-4），30.0（C-5），40.1 （C-6）。数据与文献［18］一致，故鉴定化合物Ⅶ为己内酰胺。

2.3 细胞毒活性测试

H460、MCF-7和Hep G2细胞用洛斯维（RPMI）培养基加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（×100）。化合物Ⅰ和Ⅱ均用二甲亚砜（DMSO）溶解稀释，DMSO的最终浓度不超过0.1%。取对数生长期细胞H460、MCF-7和 Hep G2用胰酶消化后计数，按1× 104个/孔种96孔平底细胞培养板，贴壁后弃去培养基，用1×PBS洗1遍，加入配好的药物，设不加药空白及DMSO对照，每个浓度3个复孔，至5%CO2培养箱内37℃内孵育24 h后终止培养，加入MTS/电子偶联剂（PMS）混合液40 μL/孔，再于37℃、5%CO2培养箱中继续孵育1～4 h后，用全波长酶标仪在490 nm波长下检测OD值［19-21］。

本实验的测定结果表明，化合物Ⅰ和Ⅱ均无体外细胞毒活性（IC50＞50 μmol/L，n=3）。

3 讨论

假耧斗菜为西藏常用中草药，药用历史悠久，疗效确切，值得进行深入的研究。本研究从假耧斗菜地上部分的乙醇提取液中分离得到了7个化合物，其中化合物Ⅲ～Ⅶ为首次从该植物中分离得到，结构类型涉及黄酮碳苷、酰胺、氰苷、酚酸和生物碱类，并首次运用MTS比色法测试了化合物Ⅰ和Ⅱ的抗肿瘤活性。实验结果为该植物化学分类学提供了一定的分类学证据，同时也丰富了对假耧斗菜的化学成分的深入认识。

［1］中国科学院西北高原生物研究所.藏药志·植物药类［M］.青海人民出版社，1991，323.

［2］孙明晓，赵婷，高昂，等.耧斗菜属药学研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2011，13（4）：83-84.

［3］陈四保，高光耀.尖萼耧斗菜的生物碱成分研究［J］.中草药，1999，30（1）：8-10.

［4］魏孝义，朱明，谢海辉，等.乳突拟耧斗菜生物碱成分的研究［J］.天然产物研究与开发，1995，7（3）：8-11.

［5］陈四保，王立为.尖萼耧斗菜中黄酮类成分的研究［J］.中国中药杂志，1999，24（3）：158-160.

［6］陈四保，高光耀，王立为，等.无距耧斗菜化学成分的研究（I）［J］.中国中药杂志，2001，26（7）：472-474.

［7］陈四保，余世春，王立为，等.无距耧斗菜化学成分的研究Ⅱ［J］.中国药学杂志，2009（z1）：38-40.

［8］朱明，魏孝义，韦壁瑜.乳突拟耧斗菜中的一新二萜成分［J］.华南植物学报，1992（1）：80-83.

［9］Xu KJ，Xu XM，Deng WL，et al.Three new flavone C-glycosides from the aerial parts of Paraquilegia microphylla［J］. Journal of Asian natural products research，2011，13（5）：409-416.

［10］Xu K，Zhang P，Liao X，et al.Two new triterpene saponins from the aerial parts of Paraquilegia microphylla［J］.Fitoterapia，2010，81（6）：581-585.

［11］云学英，高建萍，张玉娇，等.蒙药耧斗菜总黄酮提取条件的优化及含量测定［J］.内蒙古农业大学学报：自然科学版，2015（1）：1-5.

［12］云学英，吴宁远，刘晓颖.蒙药耧斗菜中阿魏酸含量的高效液相色谱法测定［J］.时珍国医国药，2015，26（3）：589-590.

［13］白雪莲.蒙古族药食两用植物耧斗菜多酚类化合物含量的季节性动态变化研究［J］.时珍国医国药，2015，26（11）：2766-2767.

［14］杨鑫宝，刘扬子，杨秀伟，等.磐安延胡索的化学成分研究［J］.中草药，2013，44（16）：2200-2207.

［15］Nakanishi T，Nishi M，Somekawa M，et al.Structures of new and known cyanoglucosides from a North American plant，Purshia tridentata DC ［J］.Chemical and pharmaceutical bulletin，1994，42（11）：2251-2255.

［16］肖皖，李宁，熊元君，等.小秋葵化学成分的分离与鉴定（Ⅱ）［J］.沈阳药科大学学报，2009，26（11）：893-895.

［17］李艳茸，李春，王智民，等.藏药甘青乌头化学成分研究（Ⅲ）［J］.中国中药杂志，2014，39（7）：1163-1167.

［18］余辉攀，肖楠，孙明谦，等.小花棘豆化学成分分离鉴定［J］.中医药学报，2013，41（6）：11-13.

［19］王洪燕，全康，蒋燕灵，等.木犀草素抗肿瘤细胞增殖及增敏抗肿瘤药物作用研究［J］.浙江大学学报：医学版，2010，39（1）：30-36.

［20］Huang S，Zhou XL，Wang CJ，et al.Pyrrolizidine alkaloids from Liparis nervosa with inhibitory activities against LPS-induced NO production in RAW264.7 macrophages［J］. Phytochemistry，2013，93：154-161.

［21］Huang S，Zhong DX，Shan LH，et al.Three new pyrrolizidine alkaloids derivatives from Liparisnervosa［J］.Chinese Chemical Letters，2016.doi：10.1016/j.cclet.2016.01.003.

Study on chemical constituents of Paraquilegia microphylla

WANG Jiaojiao WU Run LI Jiamin HUANG ShuaiZHOU Xianli
School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Sichuan Province，Chengdu 610031，China

Objective To investigate the chemical constituents of Paraquilegia microphylla.Methods The constituents were separated and purified by chromatographic methods，and their structures were elucidated by spectroscopic methods，compounds Ⅰ and Ⅱ were evaluated for their cytotoxicity against human H460 non-small cell lung cancer cells （H460），the breast cancer cell line MCF-7（MCF-7）and human hepatocellular cell line Hep G2（Hep G2）by［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium （MTS）method.Results Seven known compounds were obtained and1identified as Paraquinin A（Ⅰ），Praquinin B（Ⅱ），Berberine（Ⅲ），Menisdaurin（Ⅳ），3，4-dimethyl benzoic acid（Ⅴ），4-hydroxybenzoic acid（Ⅵ）and caprolactam（Ⅶ），the results of the cytotoxicity about compounds Ⅰ and Ⅱ were inactive against several human cancer cells.Conclusion Compounds Ⅲ-Ⅶ are isolated from this plant for the first time，the cytotoxicity of compounds Ⅰ and Ⅱ against several human cancer cells were tested for the first time.

Paraquilegia microphylla；Chemical composition；Flavonoid C-glycoside；Cyanogenic glycoside

R927

A

1673-7210（2016）06（a）-0008-03

2016-02-20本文编辑：赵鲁枫）

国家自然科学基金资助项目（81402803）；四川省教育厅创新团队项目（15TD0048）。

王姣姣（1989.8-），女，西南交通大学2013级药学专业在读硕士研究生；研究方向：天然药物化学。

周先礼（1969.1-），男，博士，教授，研究方向：药物化学。