中药凝胶治疗胶原诱导性关节炎大鼠的实验研究

林 强 杨宝华 祁文兵 白明华 王明怀 彭 页.陕西省宝鸡市中医医院骨伤一科，陕西宝鸡 7000；.陕西省宝鸡市第二中医医院骨科，陕西宝鸡 7000；.空军总医院骨科，北京 004

中药凝胶治疗胶原诱导性关节炎大鼠的实验研究

林 强1杨宝华2祁文兵1白明华1王明怀1彭 页3
1.陕西省宝鸡市中医医院骨伤一科，陕西宝鸡 721000；2.陕西省宝鸡市第二中医医院骨科，陕西宝鸡 721000；3.空军总医院骨科，北京 100142

目的 探讨中药凝胶膏剂对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠关节炎指数、足趾肿胀度及关节组织病理学的影响。 方法 取SD大鼠60只随机分为正常对照组、模型组、阳性组，以及中药凝胶膏剂大、中、小剂量组。除正常对照组外，其余大鼠均按每鼠0.3 mL胶原乳剂于尾根部皮下注射造模。除正常对照组外，模型组给予空白凝胶膏剂，阳性组给予伤湿止痛膏，中药凝胶膏剂大、中、小剂量组分别给予大、中、小剂量的中药凝胶膏剂。观察各组大鼠关节炎指数、足趾肿胀度及关节组织病理学。 结果 治疗14 d后，与正常对照组比较，其余各组大鼠体重均明显减轻（P＜0.05）。与模型组比较，阳性组和中药凝胶膏剂大、中、小剂量组体重均明显升高（P＜0.05）。治疗14 d后，与正常对照组比较，其余各组大鼠关节炎指数均明显增加（P＜0.05）。与模型组比较，阳性组和中药凝胶膏剂大、中、小剂量组关节炎指数均明显降低（P＜0.05）。治疗7 d后，与正常对照组比较，其余各组大鼠足趾体积均明显增大（P＜0.05）。与模型组比较，阳性组和中药凝胶膏剂大、中、小剂量组足趾体积均明显缩小（P＜0.05）。组织病理学结果显示，中药凝胶膏剂大、中剂量组可抑制CIA大鼠关节组织病理学改变。 结论 中药凝胶膏剂能够明显抑制CIA模型大鼠的足趾肿胀及关节组织病理学改变，降低其关节炎指数。

胶原诱导性关节炎；中药凝胶膏剂；关节炎指数；足趾肿胀；关节组织病理学

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床常见的系统性自身免疫性疾病［1］，发病机制不明，其基本病理改变与关节滑膜炎症、滑膜细胞增生、炎症细胞大量浸润［2］等关系密切。目前，临床常用的治疗RA的药物主要有非甾体抗炎药、免疫抑制剂、糖皮质激素及生物制品［3］，这些药物虽然能够缓解患者症状［3］，但有的药物毒副作用较大，有的药物半衰期短，不能长期给药［4］。中医药在治疗RA方面有自身的优势。为此，笔者建造胶原诱导性关节炎（CIA）模型大鼠［4］，给予中药凝胶膏剂治疗，观察其对CIA大鼠关节变化的影响，以期为临床治疗RA提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器

中药凝胶膏剂，由陕西省宝鸡市中医医院药学部门提供，每片（8 cm×10 cm）含雷公藤甲素254.3 μg，含青藤碱165.1 mg；空白凝胶膏剂，由陕西省宝鸡市中医医院药学部门提供；阳性药伤湿止痛膏（8 cm× 10 cm），由桂林天和药业股份有限公司提供，批号20141108。弗氏完全佐剂（FAC）、Ⅱ型胶原由北京博迈斯科技发展有限公司提供，批号20130309；液体石蜡由济南丹龙化工有限公司提供，批号20141008；甲醛由广州市安杰生物技术有限公司提供，批号20130711。ZH-ZZY型大鼠足趾容积测量仪由安徽正华生物仪器设备有限公司提供；SYD2001型切片机由沈阳誉德医疗设备厂提供；奥林巴斯CKX41倒置显微镜由上海泽途机电设备有限公司提供。

1.2 实验动物

SD大鼠，雄性，鼠龄45～60 d，体重180～200 g，由山东鲁抗医药有限公司提供，生产许可证号：SCXK（鲁）20130001。在自由饮食、光/暗周期为12 h/12 h（光照时间为6∶00～18∶00）、背景噪音为（40±10）db、温度为（20±3）°C的条件下饲养1周。

1.3 方法

取SD大鼠60只，采用随机数字表法将其分为正常对照组、模型组、阳性组，以及中药凝胶膏剂大、中、小剂量组。用脱毛膏除去大鼠背部毛，以供给药备用。将同体积的FAC与2.5 mg/mL的Ⅱ型胶原乳液混合，制成1 mg/mL的胶原乳剂，正常对照组不造模，其余大鼠均于尾根部皮下注射胶原乳剂造模，胶原乳剂用量0.3 mg/mL。1周后再次强化造模，造模方法同上，正常对照组除外，造模所用胶原乳剂量减半。造模后，若发现60只大鼠左足红肿明显，体积增大，说明造模成功。除正常对照组大鼠外，其余各组大鼠在初次造模后第2天开始给药，给药方法为将药物贴在大鼠背部、固定，1次/d，连续给药1个月。其中，模型组给予空白凝胶膏剂，阳性组给予伤湿止痛膏，中药大、中、小剂量组分别给予大、中、小剂量的中药凝胶膏剂（大、中、小剂量分别指3 cm×3 cm、2 cm×3 cm、1 cm× 3 cm的膏剂涂布面积）。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠体重的测定 在给药前及给药后7、14、21、28 d分别测量各组大鼠体重。

1.4.2 关节炎指数的测定 采用0～4级评分法对关节炎指数进行评分，满分为16分。0分：关节正常未见红肿；1分：趾关节出现红肿；2分：趾关节及足趾均肿胀；3分：趾关节以下足爪出现肿胀；4分：全部足爪均出现肿胀且关节严重变形。分数越高，关节症状越严重。

1.4.3 大鼠足趾容积的测定 采用大鼠足趾容积测量仪测定给药前及给药后7、14、21、28 d大鼠右后足趾容积。

1.4.4 病理学检查 处死大鼠，取右踝关节，用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察各组大鼠病理组织变化。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，重复测量的计量资料采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别大鼠体重比较

初次免疫后7 d，各组大鼠体重均未出现明显异常，精神较佳。治疗14 d后，与正常对照组比较，其余各组大鼠体重均明显减轻，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，阳性组和中药凝胶膏剂大、中、小剂量组体重均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

2.2 不同组别大鼠关节炎指数比较

治疗14 d后，与正常对照组比较，其余各组大鼠关节炎指数均明显上升，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，阳性组和中药凝胶膏剂大、中、小剂量组关节炎指数均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 不同组别大鼠足趾体积比较

治疗7 d后，与正常对照组比较，其余各组大鼠足趾体积均明显增大，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，阳性组和中药凝胶膏剂大、中、小剂量组足趾体积均明显缩小，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 不同组别大鼠踝关节病理组织学结果比较

病理学结果显示，正常对照组大鼠关节软骨结构

完整、表面光滑，滑膜组织未见增生，且未有充血、水肿及炎症细胞浸润出现。模型组大鼠关节软骨变薄，表面凹凸不平，滑膜组织明显增生，有充血及大量炎症细胞浸润。阳性组病变程度与中药凝胶膏剂大、中剂量组大鼠相当，关节未见明显软骨破坏、表面光滑，滑膜组织出现轻、中度变性、增生，存在少量炎症细胞浸润。中药凝胶膏剂小剂量组关节软骨有中、重度损坏，滑膜组织伴有中、重度变性及增生，关节腔内可见少量炎性渗出物。见图1。

表1 不同组别大鼠体重比较（g，±s）

表1 不同组别大鼠体重比较（g，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05

组别 只数 给药前 7 d 14 d 21 d 28 d正常对照组模型组阳性组中药凝胶膏剂大剂量组中药凝胶膏剂中剂量组中药凝胶膏剂小剂量组10 10 10 10 10 10 178.1±5.4 171.3±5.1 174.2±8.2 170.7±7.6 176.2±8.4 172.8±7.9 221.2±5.7 196.3±6.4 203.5±7.1 198.9±7.5 206.4±8.2 199.3±9.1 265.1±9.3 178.4±8.9*193.2±9.1*▲189.3±9.4*▲195.6±10.2*▲186.4±8.7*▲291.3±11.2 186.2±7.9*197.1±9.8*▲193.4±8.8*▲198.3±11.1*▲189.9±10.7*▲316.7±12.6 197.6±9.8*209.4±11.3*▲198.5±10.9*▲211.4±11.1*▲203.5±11.3*▲

表2 不同组别大鼠关节炎指数比较（±s）

表2 不同组别大鼠关节炎指数比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05

组别 只数 给药前 7 d 14 d 21 d 28 d正常对照组模型组阳性组中药凝胶膏剂大剂量组中药凝胶膏剂中剂量组中药凝胶膏剂小剂量组10 10 10 10 10 10 000000 0 0 0 0 2.13±0.61 1.76±0.72 1.79±0.51 1.89±0.72 2.34±0.43 6.61±1.32*5.42±1.23*▲4.91±0.91*▲4.76±1.14*▲5.24±1.32*▲9.92±1.52*8.34±1.33*▲7.46±1.15*▲7.86±1.32*▲8.67±1.24*▲8.98±1.24*6.87±1.22*▲5.98±1.13*▲6.64±1.31*▲7.18±1.62*▲

表3 不同组别大鼠足趾体积比较（mL，±s）

表3 不同组别大鼠足趾体积比较（mL，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05

组别 只数 给药前 7 d 14 d 21 d 28 d正常对照组模型组阳性组中药凝胶膏剂大剂量组中药凝胶膏剂中剂量组中药凝胶膏剂小剂量组10 10 10 10 10 10 1.56±0.12 1.55±0.11 1.58±0.21 1.54±0.13 1.57±0.22 1.55±0.14 1.57±0.51 1.83±0.43*1.69±0.13*▲1.65±0.21*▲1.71±0.52*▲1.74±0.31*▲1.69±0.12 2.33±0.22*1.81±0.21*▲1.79±0.13*▲1.83±0.21*▲1.88±0.14*▲1.70±0.13 2.99±0.21*1.97±0.32*▲1.89±0.23*▲1.99±0.32*▲2.03±0.24*▲1.72±0.23 3.81±0.14*2.57±0.22*▲2.48±0.15*▲2.54±0.21*▲2.65±0.14*▲

图1 大鼠踝关节病理组织图（HE，400×）

3 讨论

RA是临床常见的慢性自身免疫性疾病［5］，它的基本病理改变为关节滑膜慢性炎症形成侵袭性血管翳［6］，破坏软骨、骨与周围组织［7］，慢性炎症是RA的显著特征。近年来有研究发现［8］，其主要病理改变为滑膜细胞增生、炎症细胞浸润、最终侵蚀软骨［9］，导致关节被破坏。目前临床常用的治疗RA的药物主要有非甾体抗炎药、免疫抑制剂、糖皮质激素及生物制品［9］，这些药物虽然能够缓解患者症状［10］，但有的药物毒副作用较大，有的药物半衰期短，不能进行长期给药［11］。因此，进一步探索RA的发生机制，寻求有效的治疗RA的药物是医学界亟待解决的。

本研究所采用的中药凝胶膏剂是一种新型的外用药物剂型［12］，主要由中药雷公藤、青藤经提取，与卡波姆混合制成中药凝胶膏剂［13］。方中雷公藤具有祛风

湿、止痹痛之功效，其主要成分为雷公藤甲素［14］，现代药理学研究提示［15］，雷公藤甲素具有抗炎、抗免疫等药理作用；中药青藤具有祛风通络、除湿止痛的作用［16］，青藤碱是青藤的主要有效成分之一［17］，具有镇痛、镇静、抗炎、免疫抑制等药理作用［18］。上述中药凝胶膏剂与皮肤具有良好的偶合性［19］，可促使药物透过皮肤直达病灶，发挥药效［20］，同时可以减轻药物的不良反应。

本研究以CIA大鼠作为研究RA的动物模型，研究中药凝胶膏剂的抗RA作用。治疗14 d后，CIA大鼠足趾关节开始肿胀，与正常对照组比较有显著性差异，并逐渐延及整个足掌甚至踝关节，28 d肿胀达到最高峰，关节功能活动障碍，最终导致关节畸形。同时CIA大鼠表现食欲下降、体重减轻、活动减少、精神倦怠。组织病理学结果显示，中药凝胶膏剂可抑制CIA大鼠关节组织病理学改变。

综上所述，中药凝胶膏剂能够明显抑制CIA模型大鼠的足趾肿胀及关节组织病理学改变，降低其关节炎指数。然而，由于本研究样本量有限，疏漏之处在所难免，因此，有望今后扩大样本，对其发生机制进行研究，以期为临床有效治疗CIA模型大鼠提供更多理论依据。

［1］马丽，李作孝.白芍总苷的免疫调节功能及其临床应用［J］.中国实验方剂学杂志，2012，16（17）：24-25.

［2］Quan L，Zhang Y，Dusad A，et al.The evaluation of the therapeutic efficacy and side effects of a macromolecular dexamethasone prodrug in the collagen-induced arthritis mouse model［J］.Pharm Res，2016，33（1）：186-193.

［3］王钢，王丽琴，王佳，等.秦芫醇提物对胶原诱导性关节炎大鼠血清抗-CCP及TNF-α的影响［J］.临床心血管病杂志，2015，31（12）：1336-1339.

［4］Choi SP，Choi CY，Park K，et al.Glabretal-type triterpenoid from the root bark of Dictamnus dasycarpus ameliorates collagen-induced arthritis by inhibiting Erk-dependent lymphocyte proliferation ［J］.J Ethnopharmacol，2016，178：13-16.

［5］严国鸿，黄燕，李煌，等.双藤痹痛凝胶膏剂对胶原诱导性关节炎模型大鼠的作用［J］.中药药理与临床，2014，30 （1）：119-121.

［6］Felcenloben I，Piasecki T，Miller J，et al.Adoptively transferred Tregs accumulate in a site-specific manner and ameliorate signs of less advanced collagen-induced arthritis progress in rats［J］.Immunotherapy，2015，7（3）：215-228.

［7］李宜川，刘国玲，芦馄，等.白芍总苷对胶原性关节炎大鼠作用的实验研究［J］.中国临床药理学杂志，2011，27（11）：871-872.

［8］Xiao J，Li G，Hu J，et al.Anti-inflammatory effects of recombinant human PDCD5（rhPDCD5）in a rat collageninduced model of arthritis［J］.Inflammation，2015，38（1）：70-78.

［9］张俊宇，杜文静，吉鹏，等.胶原诱导性关节炎模型大鼠炎症细胞因子表达及白喉乌头的影响［J］.中国组织工程研究，2015，19（18）：2794-2795.

［10］Feng ZY，He ZN，Zhang B，et al.Adenovirus-mediated osteoprotegerin ameliorates cartilagedestruction by inhibiting proteoglycan loss and chondrocyte apoptosisin rats with collagen induced arthritis［J］.Cell Tissue Res，2015，362（1）：187-199.

［11］吕新亮，闫美凤，姜楠，等.痹痛康丸对胶原性关节炎大鼠IL-1β、IL-6的影响［J］.现代中西医结合杂志，2013，22（31）：3247-3249.

［12］Scales HE，Ierna M，Smith KM，et al.Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging［J］.Rheumatology，2016，55（3）：564-572.

［13］张洪长，刘明昕，张荣，等.青藤碱对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MyD88、TRAF-6表达的影响［J］.中国免疫学杂志，2015，31（4）：485-489.

［14］Cheon YH，Kim HO，Suh YS，et al.Inhibitory effects for rheumatoid arthritis of dietary supplementation with resveratrol in collagen-induced arthritis［J］.J Rheum Dis，2015，22（2）：93-101.

［15］顾夙，徐守宇.白花蛇舌草对胶原诱导性关节炎大鼠的保护作用［J］.中国生化药物杂志，2014，34（9）：64-67.

［16］Huang W，Liang Q，Chen J，et al.Quantitative proteomic analysis of synovial tissue from rats with collagen-induced arthritis［J］.RSC Advances，2015，5（105）：86088-86101.

［17］Beckmann J，Dittmann N，Schütz I，et al.Effect of M3 muscarinic acetylcholine receptor deficiency on collagen antibody-induced arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2016，18（1）：17-18.

［18］梁秀军，孙同友，董文娟，等.穿山龙总皂苷对胶原性关节炎大鼠炎症细胞因子的影响［J］.时珍国医国药，2013，24（3）：522-524.

［19］文军，荣晓凤.复方大黄散对类风湿关节炎大鼠MMP-10 及IL-33的影响［J］.免疫学杂志，2015，31（1）：41-46.

［20］Rajaram C，Reddy KR，Chandra Sekhar KB.Anti arthritic activity of caesalpinia pulcherrima against type Ⅱ collagen induced arthritis in experimental rats［J］.Int J Pharm Sci Drug Res，2015，7（2）：172-175.

Experimental research of Chinese medicine gel paste in the treatment of rats with collagen-induced arthritis

LIN Qiang1YANG Baohua2QI Wenbing1BAI Minghua1WANG Minghuai1PENG Ye3
1.The First Department of Orthopedics and Traumatology，Baoji City Chinese Medicine Hospital，Shaanxi Province，Baoji 721000，China；2.Department of Orthopedics，Baoji Second Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shaanxi Province，Baoji721000，China；3.Department of Orthopedics，Air Force General Hospital，Beijing 100142，China

Objective To discuss the effects of Chinese medicine gel paste for the arthritis index，toe swelling degree and joint histopathology in rats with collagen-induced arthritis.Methods Sixty SD rats were randomly divided into normal control group，model group，positive group，large，medium，small dose of Chinese medicine gel paste group.In addition to the normal control group，the other rats were injected subcutaneously with 0.3 mL collagen emulsion at the end of the tail to make model.In addition to the normal control group，the model group was given blank gel paste，the positive group was given Shangshi Zhitong Plaster，and the large，medium，small dose of Chinese medicine gel paste group was given large，medium，small dose of Chinese medicine gel paste respectively.The arthritis index，toe swelling degree and joint histopathology of all groups were observed.Results After treatment for 14 days，compared with normal control group，the weights of the other groups were significantly decreased （P＜0.05）.Compared with model group，the weights of positive group and large，medium，small dose of Chinese medicine gel paste group were significantly increased，the differences were statistically significant（P＜0.05）.After treatment for 14 days，compared with normal control group，the arthritis indexes of the other groups were significantly increased（P＜0.05）.Compared with model group，the arthritis indexes of positive group and large，medium，small dose of Chinese medicine gel paste group were significantly decreased，the differences were statistically significant（P＜0.05）.After treatment for 7 days，compared with normal control group，the toe volume of the other groups was increased significantly （P＜0.05）.Compared with model group，the toe volume of positive group and large，medium，small dose of Chinese medicine gel paste group were significantly decreased，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Histopathological results showed that large，medium dose of Chinese medicine gel paste group could inhibit the histopathology changes of rats with collagen-induced arthritis.Conclusion Chinese medicine gel paste can significantly inhibit the toe swelling and changes of joint histopathology in rats with collagen-induced arthritis，and reduce the arthritis index.

Collagen-induced arthritis；Chinese medicine gel paste；Arthritic index；Toe swelling；Joint histopathology

R684.3

A

1673-7210（2016）06（a）-0011-04

2016-02-02本文编辑：张瑜杰）

中国博士后科学基金资助项目（2015T81110）。

林强（1981.12-），男，硕士研究生；研究方向：骨创伤。