马鞭草总苷对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的干预作用

王琳琳 李寒冰 苗明三河南中医药大学药学院，河南郑州 450046

马鞭草总苷对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的干预作用

王琳琳 李寒冰 苗明三
河南中医药大学药学院，河南郑州 450046

目的探讨马鞭草总苷（TGV）对大鼠慢性非细菌性前列腺炎（CNP）的影响。 方法将10月龄健康Wistar大鼠50只前列腺背侧叶注射25%消痔灵造成CNP模型，随机分为模型组、前列康（1000 mg/kg）组及TGV高、中、低剂量（120、60、30 mg/kg）组，每组10只，另以10只正常大鼠作为正常组。自造模后第8天起，各给药组分别灌胃给予相应药物，模型组和正常组灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续22 d。给药结束后测定各组大鼠前列腺湿重，计算前列腺指数，检测前列腺液中白细胞数和卵磷脂小体密度，放免法测定前列腺组织匀浆中白介素-2（IL-2）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量，HE染色观察前列腺组织的病理学变化。 结果 与模型组比较，TGV高、中、低剂量组大鼠前列腺湿重、前列腺指数、前列腺液中白细胞数及前列腺组织IL-2、TNF-α、IL-1β水平降低，前列腺液中卵磷脂小体密度升高，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。形态学观察显示：TGV对CNP大鼠前列腺组织病理学改变有一定的改善作用。 结论 TGV对消痔灵诱导的CNP大鼠具有良好的抑制作用，其作用机制可能与TGV下调前列腺组织IL-2、TNF-α、IL-1β水平有关。

马鞭草总苷；慢性非细菌性前列腺炎；白介素-2；白介素-1β；肿瘤坏死因子-α

慢性非细菌性前列腺炎 （chronic nonbacterial protatitis，CNP）是成年男性泌尿生殖系统最常见的疾病之一，患者常出现会阴部、盆骨区域疼痛和尿频、尿急、尿痛、排尿不尽、排尿困难等排尿异常症状，甚至造成性功能不良，对患者的生活质量影响严重［1］。在以慢性前列腺炎就诊的临床病例中，CNP患者占到九成以上［2］。随着发病率的提高，该病的防治已日益为人们所重视。然而由于CNP的发病机制和病因目前尚不完全清楚，再加上病程迁延，反复发作，虽然现有的治疗方法和药物较多，但总体来说疗效理想的较少。近年来，应用中医药治疗CNP的报道逐渐增多。马鞭草又名凤颈草、铁马鞭，是马鞭草科植物马鞭草（Verbena officinalis L.）的干燥地上部分，具有活血散瘀、截疟、解毒、利水消肿之功效［3］。现代药理学研究提示，马鞭草具有抗菌、抗炎、镇痛、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等多种生物活性［4］。在民间，马鞭草被广泛用于治疗慢性前列腺炎［5］、前列腺增生［6］、尿路结石［7］等泌尿系统疾病，疗效确切。本实验通过考察马鞭草中的活性成分马鞭草总苷（total glucosides of Verbena officinalis L.，TGV）对CNP模型大鼠前列腺指数、前列腺炎白细胞数和卵磷脂小体密度、前列腺组织病理形态及相关细胞因子的影响，探讨其部分可能的机制，也为马鞭草的进一步研究开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠，10月龄，体重240～260 g，购于河北省医学实验动物中心，合格证编号：SCXK（冀）2008-1-003，饲养于河南中医学院实验动物中心。动物房温度20～25℃，相对湿度50%～70%，12 h交替光照，分笼饲养，自由饮水，大鼠全价营养饲料喂养，每日更换垫料，保持笼内干爽清洁。

1.2 药物与试剂

TGV（购自江苏南京青泽医药科技有限公司，批号：20090327，经紫外分光光度法测定总环烯醚萜苷含量为50.13%）；前列康片（浙江康恩贝制药股份有限公司，批号：20090122，规格：500 mg/片）；消痔灵注射液（北京双鹤药业股份有限公司，批号20070405，10mL/支）；戊巴比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：F20060715）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：X0901038）；冰醋酸（开封化学试剂总厂，批号：061208）；大鼠白介素-2（IL-2）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）放免试剂盒（北京普尔伟业生物科技有限公司，批号均为20090424）。

1.3 实验仪器

FA（N）/JA（N）系列电子天平（上海民桥精密仪器有限公司）；可调式移液器（上海雷勃分析仪器有限公司）；TGL-16G高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；DY89-1电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Sn-895B型智能放免γ测量仪（上海原子核研究所四环仪器一厂）。BX41型奥林巴斯显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.4 实验方法

取实验用大鼠50只适应性饲养1周后，参考文献［8］的方法建立CNP模型：腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠实施麻醉，仰位固定，用碘伏消毒腹部皮肤，于下腹正中切口达腹腔，提出膀胱及两侧精囊，暴露膀胱前列腺背侧叶，准确注入25%消痔灵注射液0.2 mL/只，送复脏器，逐层肌肉、皮肤缝合，碘伏消毒伤口，待清醒后放回鼠笼饲养。连续3 d肌内注射青霉素20万U/kg，以预防感染。造模后第8天，将造模的50只大鼠随机分为模型组、前列康组（阳性对照药物，1000 mg/kg，相当于成人临床用量的8倍）和TGV高、中、低剂量组（120、60、30 mg/kg，由预实验确定），每组10只。另取10只未参与造模的大鼠设为正常组。各给药组灌胃给予相应药物，正常组和模型组分别灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续22 d。末次给药1 h后，对相关指标进行检测。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 前列腺湿重和前列腺指数的测定 称体重后处死所有大鼠，迅速剖腹，剥离粘连的结缔组织和脂肪组织，完整取出前列腺，用生理盐水漂洗干净后，称量前列腺湿重，并计算前列腺指数。前列腺指数=前列腺湿重（mg）/体重（g）。

1.5.2 前列腺液白细胞计数和卵磷脂小体密度评分参考文献［9］的方法，取前列腺按摩液10～200 μL白细胞稀释液（1%醋酸溶液）中，用滴管吹打均匀后充于细胞计数板中，低倍镜下计数四角上4个大方格内的白细胞数，乘以50即为1 μL前列腺液内的白细胞总数。另取前列腺液10 μL均匀涂片，光镜下观察卵磷脂小体密度，评分标准参考临床检验标准：满视野4分，3/4视野3分，1/2视野2分，1/4视野1分［10］。

1.5.3 前列腺组织IL-2、IL-1β、TNF-α水平的测定［11］精密称取200 mg前列腺组织，用眼科剪剪碎，加入生理盐水1 mL，置于冰浴中匀浆。随后将组织匀浆在4℃下以3000 r/min离心15 min（离心半径70 mm）。取上清液按试剂盒说明书测定前列腺组织中IL-2、IL-1β、TNF-α水平。

1.5.4 前列腺组织形态学的观察 取剩余前列腺组织用生理盐水漂洗干净，滤纸吸干表面水分，用10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋切片，苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察前列腺组织形态学变化。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对CNP大鼠体重、前列腺湿重和前列腺指数的影响

各组之间大鼠体重比较差异无统计学意义 （P＞0.05），表明造模和给药对大鼠体重增长速度均无明显影响，各组大鼠前列腺湿重和前列腺指数具有可比性。与正常组比较，模型组大鼠前列腺湿重和前列腺指数显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，TGV高、中、低剂量组和前列康组大鼠前列腺湿重和前列腺指数均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠体重、前列腺湿重及前列腺指数的比较（±s，n=10）

表1 各组大鼠体重、前列腺湿重及前列腺指数的比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；TGV：马鞭草总苷；“-”表示未给药

组别 剂量［mg/（kg·d）］体重（g）前列腺湿重（mg）前列腺指数（mg/g）正常组模型组前列康组TGV高剂量组TGV中剂量组TGV低剂量组--1000 120 60 30 325.87±18.58 308.12±23.03 321.24±28.18 315.96±64.29 308.47±35.80 306.12±21.23 450.73±89.84 611.72±126.75*513.18±56.44#474.63±66.27##525.61±43.84#528.30±65.51#1.51±0.39 2.09±0.22*1.62±0.35##1.54±0.38##1.74±0.18##1.70±0.35##

2.2 对CNP大鼠前列腺液中白细胞数及卵磷脂小体密度的影响

与正常组比较，模型组大鼠前列腺液中白细胞数显著增多（P＜0.01），卵磷脂小体密度显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，TGV高、中、低剂量组和前列康组前列腺液中白细胞数显著减少（P＜0.01），卵磷脂小体密度显著升高（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠前列腺液中白细胞数、卵磷脂小体密度比较（±s，n=10）

表2 各组大鼠前列腺液中白细胞数、卵磷脂小体密度比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；TGV：马鞭草总苷；“-”表示未给药

组别 剂量［mg/（kg·d）］白细胞数（×109/L）卵磷脂小体密度评分（分）正常组模型组前列康组TGV高剂量组TGV中剂量组TGV低剂量组--1000 120 60 30 2.97±0.90 7.20±1.44*2.85±0.53##3.21±0.83##3.90±1.43##4.00±0.82##3.30±0.42 1.60±0.48*2.90±0.54##3.10±0.36##2.80±0.32##2.64±0.48##

2.3 对CNP大鼠前列腺组织IL-2、IL-1β、TNF-α的影响

与正常组比较，模型组大鼠前列腺组织IL-2、IL-1β、TNF-α水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，TGV高、中、低剂量组和前列康组大鼠前列腺组织IL-2、IL-1β、TNF-α的水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠前列腺组织IL-2、IL-1β、TNF-α水平比较（±s，n=10）

表3 各组大鼠前列腺组织IL-2、IL-1β、TNF-α水平比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；TGV：马鞭草总苷；IL-2：白介素-2；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；“-”表示未给药

组别 剂量［mg/（kg·d）］IL-2 （ng/mL）IL-1β （ng/mL）TNF-α （ng/mL）正常组模型组前列康组TGV高剂量组TGV中剂量组TGV低剂量组--1000 120 60 30 1.10±0.20 2.12±0.87*1.40±0.29#1.37±0.33#1.46±0.34#1.39±0.33#0.032±0.006 0.134±0.066*0.043±0.021##0.042±0.023##0.059±0.053#0.083±0.037#0.461±0.122 1.494±0.357*0.680±0.171##0.694±0.235##0.799±0.212##0.906±0.232##

2.4 对CNP大鼠前列腺组织形态的影响

光镜下观察各组大鼠前列腺组织切片，正常组前列腺腺体形态正常，腺腔大小均匀，腺腔内大量粉染的分泌物，间质未见炎症细胞浸润和纤维组织增生；模型组腺腔明显缩小，部分腺腔闭锁呈实体状，腺腔内分泌物减少甚至消失，间质水肿增宽，间质内可见炎症细胞浸润，纤维组织增生明显。前列康组和TGV高剂量组前列腺腺腔扩大，腺腔内分泌物增多，间质内炎症细胞浸润和纤维组织增生少见；TGV中剂量组腺腔部分恢复正常，部分腺腔内分泌物增多，间质内炎症细胞浸润明显减轻，纤维组织增生也明显减少；TGV低剂量组病理表现与模型组相似。见图1。

图1 大鼠前列腺组织HE染色结果（100×）

3 讨论

CNP病因复杂，发病机制还不确定，可能是多种因素综合作用的结果。近年来研究发现，慢性炎症的

病理改变大多是继细菌感染后刺激机体所发生的免疫反应所致，与细胞因子、炎症介质的异常改变密切相关［13］。有学者研究发现［14-15］，慢性前列腺炎患者前列腺液或者精液中IL-2、TNF-α、IL-1β水平显著高于正常人，证明IL-2、TNF-α、IL-1β确实参与了慢性前列腺炎的疾病过程。IL-2是由活化T淋巴细胞产生的一种重要的细胞因子，与细胞表面受体结合后，可激发细胞增殖信号并诱导T淋巴细胞的活化与增殖，在清除致病物的同时，亦可产生正常组织损伤［16-17］。IL-1β是由单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞和其他类型细胞在应答感染时产生的细胞因子，通过核因子κB（NF-κB）使巨噬细胞和其他细胞分泌其他细胞因子，并产生氧自由基、蛋白酶、花生四烯酸等代谢产物，致使内皮细胞受损，炎症症状加重［18］。TNF-α作为重要的促炎性细胞因子，能提高巨噬细胞的吞噬能力，诱导上皮细胞及淋巴细胞表达多种黏附分子，诱导趋化因子产生，介导炎症细胞向炎症局部聚集，造成炎症、纤维细胞增生、组织损伤等病理变化［19-20］。因此，通过检测前列腺组织IL-2、TNF-α、IL-1β的表达水平，可以评价慢性前列腺炎的治疗效果。本实验结果显示，TGV能显著降低CNP大鼠前列腺组织中IL-2、TNF-α、IL-1β的水平，控制炎性细胞因子级联反应进一步扩大，从而减轻炎性反应。

TGV是马鞭草中的主要活性部位，以环烯醚萜苷类物质为主要成分。本研究通过前列腺背侧叶注射消痔灵的方法诱导制备CNP大鼠模型进行研究发现，TGV能有效降低CNP大鼠前列腺湿重、前列腺指数、升高前列腺液卵磷脂小体密度，恢复前列腺腺体形态，减轻间质水肿、炎细胞浸润和纤维组织增生，显著改善CNP的症状，提示TGV对CNP具有较好的治疗作用，其机制可能与抑制前列腺局部IL-2、TNF-α、IL-1β等促炎性细胞因子的产生有关。

［1］游涌.前列腺炎的诊断与治疗研究进展［J］.中华全科医学，2008，6（10）：1079.

［2］Kiyota H，Onodera S，Ohishi Y，et al.Questionnaire survey of Japanese urologists concerning the diagnosisand treatment of chronic prostatitis and chronic pelvic pain syndrome［J］.Int J Urol，2003，170（17）：636-642.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：49.

［4］郭琳，苗明三.马鞭草化学、药理及临床应用探讨［J］.中医学报，2014，29（9）：1345-1347.

［5］邱峰.马鞭草治疗慢性前列腺炎36例疗效观察［J］.吉林中医药，2002，22（6）：28.

［6］曹志明.马鞭草治疗前列腺增生症［J］.中医杂志，2001，42 （7）：393.

［7］韦耀力，胡俊杰.重用马鞭草治疗泌尿系结石124例［J］.中国中医急症，2010，19（11）：1971-1972.

［8］张子梅，苗明三，张玉林.水蔓菁总黄酮对大鼠炎性前列腺组织形态和超微结构的影响［J］.现代预防医学，2009，36（16）：3116-3118，3121.

［9］何颖，沈先荣，蒋定文，等.前摄宁颗粒对大鼠慢性前列腺炎的治疗作用［J］.中成药，2011，33（4）：583-586.

［10］应国华.电镜技术与细胞超微结构［M］.香港：香港现代出版社，1993：31-79.

［11］郭凯，王峥屹，杨磊林，等.四黄前列片对慢性前列腺炎模型大鼠前列腺组织中IL-1β、TNF-α含量的影响［J］.中成药，2006，28（7）：1042-1044.

［12］曾庆琪，朱勇，孙磊，等.前列腺炎Ⅰ号对CNP大鼠血清IL-2、IL-6含量的影响［J］.世界中西医结合杂志，2013，8（10）：1058-1060，1062.

［13］纪必磊，刘小丽，张晶.原儿茶醛对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用［J］.中国医药科学，2015，5（3）：26-28，31.

［14］张亚强，卢建新，吴志奎，等.丹蒲胶囊对慢性前列腺炎患者前列腺液IL-2、IL-6水平的影响［J］.中国中西医结合杂志，2002，22（11）：828-829.

［15］桂士良，王茉琳，罗振国，等.慢性前列腺炎患者精浆中细胞因子的表达水平及临床意义［J］.中国老年学杂志，2015，35（10）：2770-2771.

［16］朱勇，孙磊，吴云皓，等.前列腺炎1号对慢性非细菌性前列腺炎大鼠前列腺组织细胞因子表达的影响［J］.安徽中医药大学学报，2014，33（5）：69-72.

［17］李树平，孟双艳，李锐.血清和前列腺液中四种细胞因子水平与慢性非细菌性前列腺炎的关系［J］.中国医师杂志，2005，7（11）：1444-1446.

［18］李军，唐东昕，龙奉玺，等.葛花解酲方对移植性肝癌小鼠外周血中免疫炎症因子含量的影响［J］.时珍国医国药，2015，26（12）：2845-2847.

［19］桂士良，王茉琳，罗振国，等.慢性前列腺炎患者精浆中细胞因子的表达水平及临床意义［J］.中国老年学杂志，2015，35（10）：2770-2771.

［20］杨琦，张建军，李伟，等.分清肾茶片对细菌致大鼠慢性前列腺炎的治疗作用及对TNF-α、IFN-γ的影响［J］.中华中医药杂志，2015，30（2）：424-428.

Effect of total glucosides of Verbena officinalis L.on rat model for chronic nonbacterial prostatitis

WANG Linlin LI Hanbing MIAO Mingsan
College of Pharmacy，He'nan University of Traditional Chinese Medicine，He'nan Province，Zhengzhou 450046，China

Objective To investigate the effect of total glucosides of Verbena officinalis L.（TGV）on rat model for chronic nonbacterial prostatitis（CNP）.Methods CNP model was established by injection of 25% Xiaozhiling through dorsal part of prostate for 50 healthy Wistar rats aged 10 months，the rats were randomly divided into 5 groups，which were model group，Qianliekang （1000 mg/kg）group，high-dose，middle-dose，low-dose （120，60，30 mg/kg）of TGV group，with 10 rats in each group.Besides，10 normal rats were recruited as normal group.Since the 8th day of modeling，the rats of each administered group have been treated with corresponding medicine by intragastric administration，the model group and normal group were given same volume of normal saline by intragastric administration，once daily，for 22 consecutive days.After delivery，the wet weight and prostate index in rat prostate were measured and calculated，and the number of white blood cells and the density of lecithin body in prostatic fluid were observed，the levels of interleukin-2（IL-2），interleukin-1β（IL-1β）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in prostate tissue of rats were detected by radioimmunoassay，and the rat prostate tissue morphology changes were observed by light microscopy after treatment. Results Compared with model group，the wet weight of prostate，the prostate index，the number of white blood cells in prostatic fluid，and the levels of IL-2，IL-1β，TNF-α in prostate tissue of the high-dose，middle-dose，low-dose of TGV group were decreased，and the density of lecithin body in prostatic fluid was increased，the differences were statistically significant（P＜0.01 or P＜0.05）.Morphological observation indicated that TGV could improve pathological conditions of prostate tissue of CNP rats to some extent.Conclusion TGV has certain therapy effect on CNP rats induced by Xiaozhiling，which may be related to its regulating the levels of IL-2，IL-1β and TNF-α.

Total glucosides of Verbena officinalis L.；Chronic nonbacterial prostatitis；Interleukin-2；Interleukin-1β；Tumor necrosis factor-α

R697.3

A

1673-7210（2016）06（a）-0004-04

2016-02-03本文编辑：张瑜杰）

国家自然科学基金面上项目（81173474）；河南省高等学校重点科研项目（16A350017）；河南中医学院苗圃工程项目（MP2011-06）。

王琳琳（1983.2-），女，中药学硕士；研究方向：中药药理学。

苗明三（1965.3-），男，博士，教授，博士生导师，主要从事中药新药研究与开发。