卵孢白僵菌NEAU30503固态培养条件优化

宋龙腾,　张鑫鑫,　于洪春,　李克斌,　杜　鹃,刘聪鹤,　孙艺峰,　许国庆

(1. 东北农业大学农学院,哈尔滨　150030; 2. 中国农业科学院植物保护研究所,北京　100193;3. 辽宁省农业科学院植物保护研究所,沈阳　110161)



卵孢白僵菌NEAU30503固态培养条件优化

宋龙腾1#,张鑫鑫1#,于洪春1*,李克斌2,杜鹃1,刘聪鹤1,孙艺峰1,许国庆3

(1. 东北农业大学农学院,哈尔滨150030; 2. 中国农业科学院植物保护研究所,北京100193;3. 辽宁省农业科学院植物保护研究所,沈阳110161)

为了提高卵孢白僵菌NEAU30503在固态培养中的产孢量,采用单因素筛选试验和响应面法对卵孢白僵菌NEAU30503固态发酵条件进行优化。在单因素试验确定最适含水量、接种量、培养温度和培养时间的基础上,应用Box-Behnken试验设计和响应面分析方法优化出最佳固态培养条件为:固态培养基含水量为55%,接种量为15 mL/100 g,培养温度为27 ℃,培养时间为7.5 d,在此条件下卵孢白僵菌NEAU30503烘干前单位产孢量达到36.72×108孢子/g。此方法适用于小型企业和生产单位对白僵菌的快速生产。

卵孢白僵菌;固态培养;培养条件;产孢量;响应面法

白僵菌(Beauveria)作为害虫主要的病原真菌,具有安全性高、致病性强、杀虫范围广、无化学农药残留、害虫不易产生抗药性、具有再生性和兼容性等优点,在国内外已广泛用于农、林业害虫的生物防治[1-2]。白僵菌主要通过昆虫体壁侵入,也可以通过消化道、气门及伤口等途径侵入虫体。其在昆虫体内大量增殖并产生毒素最终致使昆虫死亡[3-5]。已知白僵菌可以寄生15 目、149 科、700 多种昆虫和蜱螨类,特别对鞘翅目及鳞翅目害虫具有较强毒力[5-6]。目前,在我国白僵菌已广泛应用于地下害虫蛴螬、玉米螟、大豆食心虫等农业害虫及苗圃蛴螬、松毛虫、天牛等林业害虫[1, 3-5, 7]。白僵菌生物杀虫剂的生产和开发日益受到世界各国重视,世界上先后有171 种真菌杀虫剂产品问世,其中仅球孢白僵菌就达58种,占产品种类总数的33.9%;目前我国微生物农药登记品种有30个,其中球孢白僵菌产品有5个,占整个微生物农药产量的7.27%[8-9]。

白僵菌大量培养的主要方式包括液态培养、固态培养和液固两相培养3种方式[7,10]。目前最常用的培养方式是液固两相培养,这种培养方式既能缩短生产周期,又可保证大量培养的效率和所产孢子的质量。本论文试验菌株卵孢白僵菌(Beauveriabrongniartii,也称布氏白僵菌)NEAU30503来源于土壤中罹病致死的大猿叶虫成虫僵尸,在PDA培养基中菌落白色,较厚,成棉絮状,培养至第14天,产孢量为4.92×108/cm2,菌落日均增长量3.7 mm/d,对大猿叶虫、稻水象甲、蛴螬、地老虎等农田害虫具有较强致病性[2,11],是一株很有应用潜力的生防菌株。本研究采用液固两相培养方式,在成功筛选出一种简易固体培养基的基础上,探讨了卵孢白僵菌NEAU30503在该固体培养基上的培养条件,并优化各培养条件,以期获得最大产孢量,为该菌株的大量生产提供试验依据,为卵孢白僵菌NEAU30503的产业化开发和基层单位大面积生产应用防治蛴螬提供技术保障。

1　材料与方法

1.1材料

供试菌株:卵孢白僵菌(Beauveriabrongniartii)NEAU30503由东北农业大学农学院害虫生物防治研究室提供。来源于土壤中罹病致死的大猿叶虫成虫僵尸[2]。

斜面培养基为PDA培养基,其配方参见文献[2]。

液态扩大培养基为选择性SDY+无机盐培养基,其配方为:葡萄糖8 g,蛋白胨2 g,酵母浸膏2 g,NaH2PO40.2 g,MgSO40.1 g,KCl 0.1 g,蒸馏水200 mL,灭菌冷却后加入0.1%硫酸庆大霉素,以防止培养基污染。

固态培养基:按质量比,m(蛭石)∶m(麦麸)∶m(玉米粉)= 1∶1∶1。

1.2试验方法

1.2.1二级扩大培养液体培养物的制备

将卵孢白僵菌NEAU30503接种于PDA培养基斜面上，28 ℃培养12 d后收集孢子,用血球计数板进行显微计数,计数方法参照文献[2],配制成107孢子/mL的孢子悬浮液。取5 mL孢子悬浮液加入含150 mL液态培养基的500 mL三角瓶中,在27 ℃,220 r/min振荡培养72 h后备用。

1.2.2固态培养方法

取500 mL容量一致的灭菌罐头瓶,每瓶放入灭菌的固态培养基15 g,根据不同试验设计接入一定量、培养72 h的二级扩大液体培养物,混拌后用灭菌纸封口,将罐头瓶放入8#夹链袋中封口,于设定温度的生化培养箱中培养若干天，然后测定净重及产孢量。

1.2.3卵孢白僵菌固态培养条件单因素筛选

1.2.3.1初始培养物制备

接种量：以每100 g固体培养基中加入二级扩大培养的液体培养物体积来表示。

含水量：用每100 g固体培养基内所含的孢子悬浮液总体积(二级扩大培养的液体培养物体积+无菌水体积)来表示。

初始培养物制备：先将各固态培养基组分在55℃烘箱烘干4 h。将适量二级扩大培养的卵孢白僵菌孢子悬浮液与适量的无菌水混匀，然后与固体培养基混合，使接种量或培养物的最终含水量符合试验要求。以下各节初始培养物制备方法与此相同。

1.2.3.2培养温度和培养时间

在接种量为10 mL/100g，接种后基质含水量为50%的条件下，设置18、21、24、27和32℃ 5个温度，分别培养3、4、5、6、7、8、9 d后测定产孢量，具体测定方法见1.2.4.2。每组3次重复。

1.2.3.3接种后基质含水量

在培养温度为27℃的条件下，以接种量10 mL/100g为基础，补加无菌水至接种后基质含水量为40%、45%、50%、55%、60%的5个处理，每处理3次重复，培养8 d后测产孢量。

1.2.3.4接种量

在含水量50%和27℃的条件下，设置接种量分别为5、10、15、20和25 mL/100g 5个处理，每处理3次重复。培养8 d后测定产孢量。

1.2.4利用响应面法优化固相阶段培养条件

1.2.4.1设计方法

根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理,结合单因素试验结果,选取培养温度、培养时间、含水量、接种量4个因素,设计4因素3水平的响应面分析试验,中心点重复3次。利用Design-Expert 7对试验结果进行分析,得到描述各变量和响应值之间关系的多项回归模型方程:

其中:Y为响应值,b0为常数项,bi为一次项回归系数,bij是交互项回归系数,bii是平方项回归系数。对二次回归拟合的方程进行分析,求取卵孢白僵菌NEAU30503的最佳固态培养条件,并在确定后进行试验验证。试验因素与水平设计见表1。

表1　响应面试验因素与水平Table 1　Factors and levels of response surface experiment

1.2.4.2检测与分析方法

完成培养后,用灭菌玻璃棒将培养物捣碎混匀。取1 g样品于含有20 mL 0.5%吐温-60和磁石转子的三角瓶中,搅拌2 h后用血球计数板对孢子进行显微计数,重复3 次。应用Design-Expert 7 对数据进行多元回归分析,得到卵孢白僵菌NEAU30503固态培养产孢量(Y)与培养温度(A)、培养时间(B)、含水量(C)及接种量(D)的二次多项式回归方程,并进行差异显著性分析。

2　结果与分析

2.1培养时间和培养温度对产孢量的影响

培养温度与时间对卵孢白僵菌NEAU30503产孢量的影响结果见图1。在设置的5个温度下培养3 d均检测出孢子,在32℃孢子产量在第5天达到峰值,27 ℃与24 ℃在第 8～9天达到峰值,低于21 ℃时孢子产量低,增长速度缓慢。据此分析,在一定范围内,温度越高,卵孢白僵菌的生长速度就越快,达到最大产孢量的时间也就越短。方差分析结果表明,在接菌后1～3 d,各温度培养下的产孢量差异不显著,在接菌后4～9 d,27 ℃产孢量与其余各温度下产孢量差异达到显著水平。

图1　培养温度和培养时间对NEAU30503产孢量的影响Fig.1　Effects of temperature and time on sporulation of NEAU30503

在不同培养温度下,达到最大产孢量的时间和最大产孢量的数值有很大差异。其中,27 ℃下获得的产孢量最高,在第8、9天时达到峰值,分别为34.25×108孢子/g和34.46×108孢子/g,但第8天与第9天的产孢量并无明显差异。虽然32℃在第5天即达到最高产孢量,但产孢量较低,只有10.17×108孢子/g;而24 ℃在第8天达到最高产孢量也只有20.63×108孢子/g。21 ℃和18 ℃下,第9天最高产孢量也不高于12.92×108孢子/g。综合分析试验结果得出:最佳培养温度为27 ℃,培养时间为8 d。

2.2接种量对产孢量的影响

双波长法分析测定汉中莲菜支链淀粉和直链淀粉的含量…………………………………… 张 晨，江 海，孙 明，雷凯鹏（112）

不同接种量对卵孢白僵菌NEAU30503在固态培养基上孢子增殖的影响(图2)不同,在5～15 mL/100 g范围内随接种量增加产孢量逐渐增加,在接种量为15 mL/100 g时,产孢量达到最高。但接种量大于15 mL/100 g时,随接种量的增加,产孢量有减少趋势,但差异没有达到显著水平。接种量小于10 mL/100 g时,由于菌体前期生长缓慢,造成白僵菌产孢量低;接种量大于15 mL/100 g时,由于前期菌体生长过快,营养物质消耗过多,造成后期产孢过程营养不足,导致产孢量较低。故最佳接种量为15 mL/100 g。

图2　接种量对NEAU30503产孢量的影响Fig.2　Effects of inoculum ratio on sporulation of NEAU30503

2.3含水量对产孢量的影响

固态培养中含水量高低对卵孢白僵菌NEAU30503产孢量的影响见图3。当含水量小于50%时,产孢量很低,可能是因为含水量低,菌体对培养基营养的吸收能力不足,抑制了菌体的生长,从而影响产孢量;含水量在55% 时,产孢量最大;含水量大于55%时产孢量迅速下降,分析其原因可能是菌体生长过程中需要大量的氧气,而水分过高导致固态培养基的透气性降低,抑制了菌体的产孢。故固态培养基含水量为55%最为适宜。

图3　含水量对NEAU30503产孢量的影响Fig.3　Effects of water content on sporulation of NEAU30503

2.4响应面分析

响应面分析方案及试验结果见表2,方差分析结

果见表3。利用Design-Expert 7对表2中数据进行多元回归分析,得到卵孢白僵菌NEAU30503固态培养产孢量(Y)与培养温度(A)、培养时间(B)、含水量(C)及接种量(D)的二次多项式回归方程为:Y=36.40-1.56A-1.20B-0.10C+0.03D+0.38AB-1.60AC+0.37AD+0.42BC-0.63BD-0.26CD-5.86A2-1.77B2-1.29C2-2.12D2。

表2　响应面试验设计与结果Table 2　Design and results of response surface experiments

方程的决定系数R2=0.953 6,说明方程模型显著,能够反映出培养过程中白僵菌产孢量的变化规律。表3中失拟项0.258 3>0.05,说明方程失拟项不显著, 模型稳定且对试验结果预测性较好。经对回归系数的方差分析,培养温度和含水量的交互效应对白僵菌产孢量具有显著影响,培养温度与接种量的二次项都达到极显著水平,说明这两个因子对产孢量的影响较大。

利用Design-Expert 7做出响应面等高线图。由交互影响的响应面等高图(图4)可看出,A、B、C、D存在极值点,对回归方程取一阶偏导数,可以得到曲面的最大点,即4个因子最优试验点(A、B、C、D)的编码值(-0.14、-0.36、-0.01、0.05),即培养温度为26.86 ℃,培养时间为7.64 d,含水量为54.99%,接种量为15.05 mL/100 g,产孢量最高预测值达到36.72×108孢子/g。为便于实际应用,将培养参数优化为培养温度为27 ℃,培养时间为7.5 d,含水量为55%,接种量为15 mL/100 g。

图4　两因素交互影响产孢量的响应面和等高线Fig.4　Response surface and contour maps of spore output of two-factor interaction

变异来源Source平方和Sumofsquare自由度df均方MeansquareF-value显著性P-value模型Model1153.96 1482.42571 22.04248<0.0001培养温度(A)Temperature58.20388158.2038815.565020.0013

续表3Table 3(Continued)

变异来源Source平方和Sumofsquare自由度df均方MeansquareF-value显著性P-value培养时间(B)Culturetime34.34027134.340279.1833560.0084含水量(C)Watercontent0.23503310.2350330.0628530.8054接种量(D)Inoculumratio0.01627410.0162740.0043520.9483AB2.34470112.3447010.6270250.4408AC41.03993141.0399310.9750.0047AD2.15725112.1572510.5768970.4593BC2.81258112.8125810.7521470.3995BD6.40726916.4072691.7134470.2102CD1.10686211.1068620.2960.5944A2940.70881940.7088251.5666<0.0001B286.22281186.2228123.057910.0002C245.54686145.5468612.180250.0033D2123.50321123.503233.02751<0.0001Residual56.09105153.739403Lackoffit55.65789105.56578964.246380.2583Pureerror0.4331650.086632Correctedtotal1210.05129

3　讨论

随着白僵菌生物杀虫剂需求量的不断增加,白僵菌培养方法的研究受到广泛重视。然而在白僵菌培养过程中能影响产孢量的因素除了培养方法以外,培养条件对白僵菌的产孢影响也尤为重要,通过优化培养条件来提高白僵菌产孢量也是生产白僵菌生防制剂的重要内容之一。传统优化培养工艺的方法较多,有单因素法、正交实验法、模糊逻辑学法和数学统计方法等,但费时费力,且常忽略因子之间的交互作用,从而使得优化结果不理想[12]。响应面法是微生物培养工艺优化中常用的方法之一,它可建立连续的三维变量曲面模型,能反映出单因素和多种因素间的交互作用对微生物生长的影响[13],被认为是较为准确可靠的优化方法[14-15]。通过单因素试验结果筛选出影响白僵菌产孢量的主要影响因子,再通过响应面法优化出最佳培养条件,可减少大量的筛选试验,并能提高试验结果的准确性,可作为微生物培养测定的方法。

本研究通过试验验证,其湿重产孢量可达到36.72×108孢子/g。经烘干测试含水量,物料湿重约为干重的3倍以上,据此可推测出干重的单位产孢量达到每克百亿孢子以上。该培养条件生产白僵菌,对生产环境和生产设备要求低,可操作性强,生产成本较低,非常适合小型企业和生产单位快速生产白僵菌用于害虫生物防治需要,显现出较好的生产应用前景。

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(责任编辑：杨明丽)

Optimization of solid-state culture conditions forBeauveriabrongniartiiNEAU30503

Song Longteng1,Zhang Xinxin1,Yu Hongchun1,Li Kebin2,Du Juan1,Liu Conghe1,Sun Yifeng1,Xu Guoqing3

(1. College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin150030, China; 2. Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China; 3. Institute of Plant Protection, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Shenyang110161, China)

Single factor screening test and response surface method were used to optimize the fermentation conditions in order to improve spore production ofBeauveriabrongniartiiNEAU30503. The suitable water content, inoculation amount, fermentation temperature and fermentation time were determined by single factor experiments. By using Box-Behnken experimental design and the response surface analytical method, the optimum fermentation conditions were obtained: the water content in solid medium was 55%; inoculation amount was 15 mL/100 g; culture temperature was 27 ℃ and culture time was 7.5 d. Under these conditions,B.brongniartiiNEAU30503 sporulation capacity reached 36.72×108conidia/g before drying. This method is suitable for small business and factories for fast spore production.

Beauveriabrongniartii;solid-state culture;fermentation condition;sporulation capacity;response surface method

2015-01-16

2015-05-15

公益性行业(农业)科研专项(201003025)

E-mail:hongcyu@126.com

S 476.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.022

# 对本文同等贡献，为并列第一作者