转基因抗虫耐除草剂(Cry1Ac+EPSPS)玉米对草甘膦耐受性研究

江　帆,　刘凯强,　张天涛,　白树雄,　王振营,　何康来

(中国农业科学院植物保护研究所,北京　100193)



转基因抗虫耐除草剂(Cry1Ac+EPSPS)玉米对草甘膦耐受性研究

江帆,刘凯强,张天涛,白树雄,王振营,何康来*

(中国农业科学院植物保护研究所,北京100193)

将具有我国自主知识产权的抗虫、耐除草剂基因转化到玉米中获得兼具抗虫和耐除草剂的复合性状转基因玉米,实现了玉米复杂性状的有效改良,研究了转耐除草剂CC-2基因和可表达Bt毒素的cry1Ac基因的双抗玉米对除草剂的耐受性及目标蛋白表达量。通过调查喷施除草剂后玉米植株存活率及株高和生长发育情况,研究了转抗虫耐除草剂基因玉米‘CC-2×BT799’、抗虫玉米‘BT799’、耐除草剂玉米‘CC-2’,以及常规玉米‘郑58’在田间对除草剂的耐受性,并用ELISA测定了供试品种中CP4 EPSPS和Cry1Ac蛋白含量。对草甘膦的耐受性试验表明,转复合基因玉米‘CC-2×BT799’与单抗草甘膦品种‘CC-2’对草甘膦均具有良好的耐受性。心叶期喷施草甘膦推荐施用剂量中量和2倍剂量对其株高和后期生长发育无不良影响。ELISA检测显示,CP4 EPSPS蛋白在雄穗中的表达量较叶片稍高。且双抗品种‘CC-2×BT799’较‘CC-2’中的CP4 EPSPS蛋白含量稍高。在雄穗中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量与‘CC-2×BT799’相当。在叶片中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量约为‘CC-2×BT799’的2倍。抗虫耐除草剂玉米能够有效抵御草甘膦的喷施,Cry1Ac蛋白含量在不同品种不同组织中存在差异。

抗虫耐除草剂玉米;存活率;耐受性;ELISA

玉米是我国种植面积居首的重要的粮、饲和能源作物。虫害和杂草是危害玉米生产的两大重要生物灾害因素[1-2]。虽然传统的玉米害虫防治技术和除草方法可取得良好的防治效果[3-4],但由于存在操作复杂、不易实施、成本高或费工费时等缺点,生产上推广应用和实际效果都受到一定影响。作为现代生物技术的成果,转基因作物为玉米田除草和害虫防治开辟了新的途径。自1996年具有抗虫或耐除草剂单一性状的转基因玉米在北美商业化种植以来,全球种植转基因玉米的国家迅速增加,现已达到17个,转基因玉米的种植面积占全球玉米种植面积的32%。2013年,菲律宾有将近40万农民从转基因玉米种植中获益[5]。随着单一抗虫或耐除草剂性状转基因玉米在生产上成功应用,兼具抗虫和耐除草剂的转基因玉米相继在2001年用于生产,且种植面积迅速增长,到2007年种植抗虫和耐除草剂复合性状转基因玉米的面积已超过转单一性状基因玉米的种植面积。2009年,陶氏益农公司研发了含有8个基因(pat、cp4epsps、cry1Fa2、cry1A.105、cry2Ab、cry3Bb1、cry34Ab1、cry35Ab1)的兼抗多种害虫和耐除草剂转基因玉米,该品种一方面可以防治鳞翅目和鞘翅目的害虫,另一方面对含草甘膦和草铵膦的除草剂有很好的耐受性[6]。目前,抗虫和抗除草剂的复合性状转基因玉米(包括BT/HTBT/BTBT/BT/HT 3种复合)种植面积达到3 730万hm2,共有9个国家种植[7]。种植复合性状转基因玉米保护玉米免受虫害,并促进田间杂草化学防除。

玉米螟是我国玉米上的主要害虫。国外转Bt基因玉米对亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)和欧洲玉米螟(O.nubilalis)等鳞翅目害虫具有良好的防治效果[7-10]。近年来,已有国产转Bt基因玉米防治玉米螟效果的报道[4,11]。王月琴等[12]报道了通过传统回交转育方法将转cry1Ac基因抗虫玉米‘BT799’和转epsps基因耐草甘膦(glyphosate)玉米‘CC-2’的2个基因导入到骨干自交系‘郑58’中,获得具有抗玉米螟和耐草甘膦的复合性状转基因玉米品系。

本研究以具有抗虫、耐除草剂复合性状转基因玉米‘CC-2×BT799’为研究对象,从目标蛋白表达量、目标性状的表达方面将其与单性状转基因玉米品系‘CC-2’及常规玉米进行了比较研究。

1　材料与方法

1.1供试转基因玉米

试验所用玉米品系包括表达mCry1Ac基因的转基因抗虫玉米‘BT799’,表达maroACC基因的转基因耐除草剂玉米‘CC-2’和具有抗虫、耐除草剂复合性状转基因玉米‘CC-2×BT799’,以及受体对照玉米‘郑58’,均由中国农业大学玉米中心提供。‘BT799’和‘CC-2’转基因玉米转化受体为HiIIA×HiIIB,后期以‘郑58’为轮回亲本进行回交,本试验所使用的抗虫试验材料为‘BT799×郑58 BC4F3’纯合家系,耐除草剂试验材料为‘CC-2×郑58BC4F2’分离群体,群体中阳性植株占75%。抗虫、耐除草剂复合性状材料为(‘CC-2×郑58BC4F1’)×(‘BT799×郑58 BC4F3’)分离群体,群体中抗虫阳性植株为100%,耐除草剂阳性植株为50%。供试玉米品系分别种植在河北省廊坊市中国农业科学院植物保护研究所科研中试基地和吉林省公主岭市吉林省农业科学院果树研究所试验基地。

1.2供试除草剂

41%草甘膦异丙胺盐(glyphosate-isopropylammonium)水剂,由美国孟山都公司生产。

1.3CP4 EPSPS和Cry1Ac蛋白表达量测定

将田间待检植株标记、编号,采集待测玉米组织立即放于液氮中。冷冻干燥后转入-80 ℃保存。采用Agdia公司的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒测定。

1.4草甘膦耐受性试验

试验设置3个草甘膦浓度,0(清水对照)、3 000和6 000 mL/hm2,兑水525 L。用Agrolex新加坡利农喷雾器,在玉米生长至7～8叶期均匀喷施。喷施草甘膦前,记录每小区的玉米植株数。在廊坊试验田分别于喷施后1周、2周和4周记录各小区内存活玉米植株数、药害症状。于喷施草甘膦后第4周(播种后第62天)采用五点取样法调查各小区存活的玉米株高15株。在公主岭试验田于喷施后1周记录各小区内存活玉米植株数及药害症状。

1.5试验设计与数据分析

除草剂试验小区面积24 m2,每个处理重复3次,小区间隔1.0 m。整个生育期不使用农药,抗螟性鉴定小区面积24 m2,每个处理重复3次。

对除草剂试验各处理存活植株数和株高,抗螟性鉴定各品系食叶级别、单株活虫数、单株蛀孔数和单株隧道长度,各玉米品系蛋白表达量等的差异显著性进行方差分析。平均数比较采用Duncan’s测验。所有统计计算采用SAS分析软件进行。

2　结果与分析

2.1转基因玉米CP4 EPSPS和Cry1Ac蛋白表达量

在转CP4 EPSPS基因耐除草剂玉米品系‘CC-2’中均能检测出CP4 EPSPS蛋白表达。抗虫耐除草剂复合性状转基因玉米品系‘CC-2×BT799’的CP4 EPSPS蛋白在叶片中检出率为37.5%,在雄穗中的检出率为50.0%。‘CC-2’与‘CC-2×BT799’ 叶片中CP4 EPSPS蛋白的平均含量分别为35.42 μg/g(蛋白/组织干重)和49.85 μg/g,雄穗中平均为44.54 μg/g和58.63 μg/g(图1)。

图1　转基因玉米不同部位中CP4 EPSPS蛋白的表达量Fig.1　Expression levels of CP4 EPSPS in different part of transgenic corn

在雄穗中,‘BT799’的Cry1Ac含量与‘CC-2×BT799’相当,分别为581.06 ng/g和585.23 ng/g。在叶片中,‘BT799’的Cry1Ac含量约为‘CC-2XBT799’的2倍,分别为1 146.82 ng/g和501.65 ng/g(图2)。

在玉米组织中,CP4 EPSPS与Cry1Ac蛋白的含量比约为5∶1～7∶1之间。

2.2转基因玉米对草甘膦的耐受程度

在廊坊和公主岭实验基地,喷施草甘膦1周后,常规玉米品系‘郑58’和转单基因抗虫玉米品系‘BT799’

植株开始出现叶片失绿、萎蔫、下部叶片变黄、生长减缓甚至停滞等药害症状,随时间推移,药害程度不断加重,1周后绝大多数植株萎蔫、干枯直至死亡。2013年在廊坊种植的单抗草甘膦‘CC-2’在喷施草甘膦4周后,喷施正常剂量和2倍剂量的存活率分别为87.7%和86.5%以上(理论存活率75%)。杂交后未经筛选的抗虫耐除草剂品种‘CC-2×BT7999’喷施除草剂正常剂量和2倍剂量的存活率分别为47.8%和43.8%,与理论存活率50%左右基本接近。存活的植株能正常生长发育,没有表现出明显的受害症状。2014年种植的单抗草甘膦‘CC-2’在喷施草甘膦正常剂量和2倍剂量4周后的存活率分别为74.4%和75.3%(表1,2)。

图2　转基因玉米不同部位中Cry1Ac的表达量Fig.2　Expression levels of Cry1Ac in different part of transgenic corn

喷施后第4周,喷施清水的4个玉米品系间株高无显著差异,喷施草甘膦正常剂量和2倍剂量后,‘郑58’和‘BT799’全部死亡,‘CC-2×BT799’和‘CC-2’间无显著差异(表3)。

表1　喷施不同浓度草甘膦后转基因玉米存活率1)Table 1　Survival rates of transgenic corn after spraying glyphosate at different concentrations

续表1Table 1(Continued)

品种Variety施药剂量/mL·(667m2)-1Dosage玉米存活率/% Survivalrate廊坊(2013)Langfang公主岭(2013)Gongzhuling1周后Oneweek2周后Twoweeks4周后Fourweeks1周后Oneweek郑58400(0.0±0.0)c(0.0±0.0)c(0.0±0.0)c(0.0±0.0)cBT799(0.0±0.0)c(0.0±0.0)c(0.0±0.0)c(0.0±0.0)cCC-2(98.8±0.4)a(90.6±3.6)a(89.0±2.5)a(99.5±0.5)aCC-2×BT799(53.1±5.7)b(50.3±3.7)b(48.8±3.1)b(47.7±3.9)b

1) 表中数据为平均值±标准差。同一施药剂量下不同品种后面有不同字母者表示差异显著P<0.05。

Data are mean±SE, The lowercase letters in the same list indicate significant difference (LSD test,P<0.05).

表2　2014年于廊坊试验田喷施不同浓度草甘膦4周后转基因玉米存活率Table 2　Survival rates of transgenic corn four weeks after spraying glyphosate with different concentrations in Langfang, 2014

表3　喷施草甘膦4周后各玉米品系的株高1)Table 3　Plant heights of transgenic corn after spraying glyphosate with different concentrations

1) 表中数据为平均值±标准差。同一施药剂量下不同品种后面有不同字母者表示差异显著P<0.05。

Data are mean±SE; the lowercase letters in the same list indicate significant difference (LSD test,P<0.05).

3　讨论

性状复合有多种途径[13]。然而,国际上已商业化应用的复合性状转基因作物大都是采用育种复合获得的产品[5,14]。在一些国家,通过育种复合多个性状的转基因作物的商业化在监管上不需要再评估[15]。通过育种复合可获得不同性状如既抗虫又耐除草剂或抗不同种类的害虫或具有抗性治理功能的转基因作物[16-18]。本研究选用的表达Cry1Ac抗虫和CP4 EPSPS耐除草剂的转基因玉米是通过常规育种复合获得的既抗虫又耐除草剂的玉米材料,既有良好的抗玉米螟性,又有良好的草甘膦耐受性。

本研究表明,CP4 EPSPS蛋白在雄穗中的表达较叶片稍高,且双抗品种较‘CC-2’中的CP4 EPSPS蛋白含量稍高。在玉米组织中,CP4 EPSPS蛋白含量高达Bt蛋白的5倍。ELISA检测,雄穗中‘CC-2×BT799’‘的Cry1Ac含量与BT799’近似,在叶片中 ‘CC-2×BT799’‘的Cry1Ac含量只有‘BT799’的1/2,较王月琴等[12]报道的‘BT799’的叶片、花丝、苞叶和籽粒中的含量均低,介于BT-X、BT-181、BT-38、BT-105和BT-43这几个转化事件之间[11]。根据叶片中‘CC-2×BT799’的Cry1Ac含量与‘BT799’中含量的比例关系推测,抗除草剂基因maroACC在一定程度上影响了Cry1Ac蛋白的表达,这在前人的研究中未见报道。而‘BT799’、‘CC-2×BT799’在各器官中Bt蛋白的时空表达与‘MON810’和‘BT11’也存在差异[18],说明不同品系的Bt蛋白时空表达存在差异,其抗虫效果也有不同。

‘BT799’田间抗螟性鉴定表明,‘CC-2×BT799’和‘BT799’在心叶期和花丝期玉米螟为害比常规种‘郑58’和单耐除草剂品种‘CC-2’显著降低,与已报道的转cry1Ac基因玉米‘BT-X’结果一致,说明‘CC-2×BT799’和‘BT799’均能有效防治亚洲玉米螟的一代和二代为害[12]。尽管双抗品种叶片中的Cry1Ac含量比‘BT799’较低,但其也达到了良好的抗虫效果。但本试验结果也显示,供试复合性状的转基因玉米‘CC-2×BT799’和单抗虫转基因玉米‘BT799’中的Cry1Ac蛋白含量与美国孟山都公司研发的第1代转Bt基因玉米转化事件MON810叶片中Cry1Ab蛋白的表达量还有一定差距[20]。

对草甘膦的耐受性试验表明,转复合基因玉米‘CC-2×BT799’与单耐草甘膦品种‘CC-2’对草甘膦均具有良好的耐受性。心叶期喷施草甘膦推荐剂量和2倍剂量对其株高和后期生长发育无不良影响。与赫福霞报道的同样具有我国自主知识产权的转cry1Ah、cry1Ie和耐草甘膦基因2mG2-epsps的多价转基因玉米结果相似[21]。金丹也筛选得到了11个T0代高表达单拷贝的转CrylAbNJB杀虫蛋白基因和epsps抗草甘膦基因的抗虫耐除草剂玉米 ‘G3-NJB’株系[22]。这都是我国通过植物转基因技术成功培育的具有抗虫耐除草剂优良性状的转基因玉米新品种,为加快推进我国抗虫耐除草剂玉米的产业化进程迈出重要一步。

本研究通过蛋白表达量的测定以及对草甘膦耐受性的检测证明,供试品系‘CC-2×BT799’尽管在表达量上与‘CC-2’和‘BT799’存在一定差异,但该品系‘BT799’能高效表达Cry1Ac和CP4 EPSPS蛋白,且对草甘膦的耐受性良好,具有应用和推广价值。

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(责任编辑：田喆)

Tolerance of transgenic and herbicide-and insect-resistant corn to glyphosate

Jiang Fan,Liu Kaiqiang,Zhang Tiantao,Bai Shuxiong,Wang Zhenying,He Kanglai

(Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

Insect-resistantcry1Acgene and glyphosate-tolerant gene were used to construct an insect-resistant/glyphosate-tolerant bivalent plant which had been patented. It effectively improved complex traits in corn. This study mainly evaluated the tolerance of insect-resistant/glyphosate-tolerant bivalent corn and glyphosate-tolerant corn to glyphosate, and measured the quantity of Cry1Ac and CP4 EPSPS protein expressed in corn tissues, in order to provide the basis for the improvement and application of the maize varieties. Insect-resistant/glyphosate-tolerant bivalent corn ‘CC-2×BT799’, insect-resistant corn ‘BT799’, herbicide-resistant corn ‘CC-2’, and conventional corn ‘Zheng 58’ were compared by investigating the survival rates and heights of plants after spraying herbicides. Cry1Ac and CP4 EPSPS protein expression was measured by ELISA. ‘CC-2’ and ‘CC-2×BT799’ performed excellent tolerance to glyphosate after spraying glyphosate with recommended and double recommended rates at the whorl stage. ELISA detection showed that CP4 EPSPS protein expression in the tassel was slightly higher than in leaves. CP4 EPSPS protein expression in ‘CC-2×BT799’ was slightly higher than in ‘CC-2’. Cry1Ac protein expression in BT799 and ‘CC-2×BT799’ was nearly the same in the tassel. However, Cry1Ac protein expression in BT799 leaves was about 2 times of that in ‘CC-2×BT799’. Insect-resistant/glyphosate-tolerant corn showed strong resistance to glyphosate. Cry1Ac protein expression varied among the corn varieties and tissues.

insect-resistant/glyphosate-tolerant corn;survival rate;tolerance;ELISA

2015-02-25

2015-07-07

国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2013ZX08003-001)

E-mail:klhe@ippcaas.cn

S 435.13, Q 78

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.012