芹菜素诱导膀胱癌 5637细胞凋亡的机制研究

谢杨春 邓永诚 田 黎

深圳市坪山新区人民医院中医科，广东 深圳 518118

芹菜素诱导膀胱癌 5637细胞凋亡的机制研究

谢杨春 邓永诚 田 黎

深圳市坪山新区人民医院中医科，广东 深圳 518118

目的：研究芹菜素诱导人膀胱癌5637细胞凋亡的作用机制。方法：采用25～100μmol/L芹菜素处理膀胱癌5637细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；采用Western blotting检测细胞凋亡相关信号分子Bax、Bcl-2和 PARP蛋白的表达水平。结果：芹菜素处理使细胞 Bcl-2蛋白表达降低且呈浓度依赖性，并使 Bax的表达增加和导致 PARP蛋白发生切割且呈浓度依赖性。结论：芹菜素能够抑制人膀胱癌5637细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与下调 Bcl-2并上调Bax表达，导致 Bcl-2/Bax比值下降，PARP活化有关。

芹菜素；膀胱癌；细胞凋亡；机制

膀胱癌的全球发病率在全身恶性肿瘤中占第9位。而在我国，膀胱癌是泌尿系统中最高发的一种恶性肿瘤。临床上根据分期可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌［1］。其中非肌层浸润性膀胱癌占发病率70%，其主要治疗方法为经尿道膀胱肿瘤电切术 （transurethral resection of bladder tumor，TUR-Bt）加术后膀胱灌注化疗，膀胱灌注化疗常用药物包括表柔比星、丝裂霉素、吡柔比星、阿霉素、羟基喜树碱等［2］，虽经过严格术后灌注方案，仍有20%左右的肿瘤患者术后仍会复发。而肌层浸润性膀胱癌中有一部分患者的治疗主要需采用以顺铂为主的化疗方案［3］，顺铂的化疗方案疗效虽然敏感，但不能持久，患者5年生存率仅为 20%～40%。而且，目前常用的化疗药物存在不同程度的全身或局部毒副反应，包括骨髓抑制、过敏反应以及膀胱刺激征等。这些方法虽然在一定程度上取得一定的疗效，但是通常给患者带来不可逆转的系统毒性以及严重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等［4］。因此，寻求无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物十分迫切。

芹菜素 （5，7，4′-三羟基黄酮），是一种广泛存在于果蔬中的一种黄酮类化合物，具有多种药理活性［5-6］，其中以抗肿瘤活性研究较多。研究表明芹菜素在体外能够显著抑制多种类型的肿瘤细胞的生长增殖和诱导其凋亡，包括：人胃癌细胞［7］、人卵 巢癌［8］、人 结肠 癌细 胞［9］、人乳 腺 癌MDA-MB-231细胞［10］、人肝癌 Hep G2细胞［11］、HeLa细胞［12］等，而其对膀胱癌细胞的作用机制研究鲜有报道。本实验观察了芹菜素对人膀胱癌5637细胞的生长抑制以及诱导凋亡作用，探讨其促进细胞凋亡的作用机制。

1 实验材料

1.1 试剂 芹菜素（质量分数≥98%，批号：22806）购自阿拉丁公司；MTT，低熔点琼脂糖、二甲基亚砜 （DMSO），蛋白酶抑制剂购自Sigma；RPMI1640培养基，胎牛血清 （Fetal bovine serum，FBS）均购自 GIBCO公司；人抗兔 Bax，Bcl-2，PARP抗体购自 Santa Cruz，GAPDH抗体购自 Abcam，BCA蛋白定量试剂盒和羊抗兔/鼠二抗购自Pierce；PVDF膜 Millipore；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞株及细胞培养 人膀胱癌细胞株5637购自中国科学院上海细胞库；培养于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液中，于 37℃、5%CO2、95%O2细胞培养箱内常规传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

2 实验方法

2.1 MTT法检测芹菜素对膀胱癌细胞5637增殖的影响 将5637细胞以3×103/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后每孔分别加入100μL不同浓度的芹菜素 （25、50、75和 100μmol/L），每个浓度设 4个重复，同时设立空白对照组 （加同体积的DMSO），细胞培养72h后，向每孔加入20μL 5.0 g/L 的MTT后继续培养 4h，弃上清，向每孔中加入200μL DMSO溶解结晶紫，置于摇床振荡 30min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪490nm波长处测定每孔吸光度值（A），并计算细胞增殖率（%）=（药物处理孔A值-空白孔A值）/（对照孔 A值-空白孔 A值）×100%。实验重复3次。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将5637细胞以2×106/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的芹菜素 （50、75、100μmol/L），处理24h后收集细胞，并调整细胞数至 1×106/mL，用预冷PBS洗涤细胞2次，弃上清液。加入100μL染料结合缓冲液重悬后，加入 10μL AnnexinVFITC染色，混匀后室温避光静置15min，然后加入200μL的染料结合缓冲液和5μL PI染液 （50mg/ L），静置5min，立即进行流式细胞仪分析。

2.3 Western blotting检测 Bax、Bcl-2和 PARP蛋白表达 将 5637细胞以2×105/孔接种于 6孔板中，以 75、100μmol/L芹 菜 素作用 细 胞24h后，收集细胞，在每管细胞中加入 100μL的蛋白裂解液后，BCA法进行总蛋白定量，每泳道上 样 量 为40μg总蛋 白，经 10% SDSPAGE电泳后转移至 PVDF膜上。一抗稀释浓度分别为：Bax（1∶3000）、Bcl-2（1∶2000）、PARP（1∶2000）、GAPDH（1∶10000）。羊抗兔/鼠二抗为 1∶5000稀释。ECL化学发光液，X光片暗室曝光、显影及定影。采用 WO-9413B型凝胶成像。实验重复 3次。

2.4 统计学分析 采用 SPSS 11.0统计软件进行数据处理，实验数据均以均数 ±标准差表示，组间差异显著性比较采用 t检验，以 P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用 为了研究芹菜素对膀胱癌细胞增值的作用，采用不同浓度芹菜素 （25、50、75和 100μmol/L）处理膀胱癌5637细胞48 h后，采用MTT法检测各个组细胞增值效率，研究结果显示，不同浓度芹菜素处理的细胞的增殖均受到不同程度的抑制，与空白对照组相比具有显著性差异 （P＜0.05，图 1）。芹菜素对 5637细胞增殖的抑制作用呈一定的浓度依赖性，采用不同浓度 （25、50、75和100μmol/L）芹菜素处理后，随着处理浓度的增加，其抑制效果更明显。芹菜素对 5637细胞的抑制呈现浓度依赖的特征。

图1 不同浓度的芹菜素对5637细胞增值的抑制效率

3.2 Annexin V/PI 双染法流式细胞仪检测芹菜素诱导 5637细胞的凋亡率为了研究芹菜素对膀胱癌细胞的诱导凋亡的作用，根据 MTT实验结果，采用不同浓度芹菜素 （50、75和 100μmol/L）处理膀胱癌5637细胞24 h后，采用 Annexin V/PI双染法流式细胞仪检测各个组细胞的凋亡效率，研究结果显示 （图 2和图 3），0、50、75和 100 μmol/L芹菜素处理组细胞凋亡率分别为 （2.3± 0.8）%、 （14.3±2.9）%、 （20.0±5.9）%和（63.8±6.2）%，与对照组相比差异显著 （P＜0.05）。随着芹菜素处理浓度的增加，其诱导膀胱癌5637细胞凋亡效率效果更明显，提示芹菜素对5637细胞的凋亡诱导效应具有剂量依赖性。

图2 Annexin-v与PI双标记流式细胞仪检测芹菜素对5637细胞凋亡诱导

图3 Annexin-V与PI双标记不同浓度的芹菜素 对5637细胞凋亡有道检测统计结果

3.3 芹菜素对Bax、Bcl-2和 PARP蛋白表达的影响 为了探讨芹菜素对膀胱癌细胞的诱导凋亡的作用机制，采用不同浓度芹菜素 （75和 100 μmol/L）处理膀胱癌5637细胞24h后，采用Western-blotting检测各个组细胞的凋亡相关蛋白的表达，研究结果显示，75和 100μmol/L芹菜素芹菜素处理5637细胞 24h后，进行蛋白检测。检测结果表明，随着浓度增加，Bax蛋白表达逐渐增加，PARP蛋白的切割水解亦逐渐增加，而Bcl-2蛋白表达逐渐降低，因此 Bcl-2/Bax比值逐渐下降（图4）。随着芹菜素处理浓度的增加，膀胱癌5637细胞中，Bcl-2与剪切的 PARP蛋白表达量逐渐降低，Bax蛋白表达量逐渐增高，结合以上实验结果，提示芹菜素对 5637细胞的凋亡可能是通过上调Bax和下调 Bcl-2蛋白表达，激活 PARP的活性，从而诱导 5637细胞的凋亡，并且这种诱导效应具有剂量依赖性。

图4 不同浓度的芹菜素作用5637细胞后，Bax、 Bc1-2和PARP蛋白表达

4 讨论

芹菜素是具有多种生物活性的黄酮类化合物，多项研究结果已经证实，芹菜素对体内、外多种癌细胞具有杀伤作用，其作用机制可能是通过对细胞凋亡的基因调控实现的，主要通过如 Rb、p53及周期蛋白依赖性激酶抑制因子如p15、p16、p21等［13］。抗癌活性是芹菜素的主要活性之一，细胞凋亡是基因调控细胞程序性死亡的过程，凋亡异常与肿瘤发生发展有密切关系。细胞凋亡敏感性主要取决于于多种凋亡相关基因表达产物的水平及相互作用，存在着多种控制细胞凋亡的复杂的调控系统。

体内肿瘤细胞生长主要是由于对机体正常调控机制的逃逸来实现的，细胞正常的凋亡调控机制受到严格的控制。对多种肿瘤细胞株，芹菜素以浓度及时间依赖性的方式诱导出现细胞皱缩、染色体凝集及DNA碎裂等特征性凋亡检测标志。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。本研究采用Annexin-V荧光与PI双染色技术在 5637细胞中也获得同样结论。芹菜素能抑制人膀胱癌 5637细胞生长，诱发细胞凋亡。

Bcl-2和 Bax基因家族在细胞凋亡过程中起着重要的调节作用［14］，Bcl-2和Bax蛋白之间的比例影响着细胞对各种凋亡诱导分子的敏感性，直接决定下游Caspases活化与否，从而决定凋亡是否发生。PARP正是 Caspase的切割底物，切割过的PARP不能正常发挥功能，引起 DNA的断裂［15］。PARP切割降解是细胞凋亡的标志之一。通过Westernblotting检测发现75、100μmol/L芹菜素处理后，PARP的切割增加，并且这种增加是浓度依赖性的。Bcl-2表达量多，细胞易于存活，而当Bax表达量过多时，容易形成 Bax同源二聚体，导致细胞容易发生凋亡。通过Westernblotting检测发现75、100μmol/L芹菜素可降低 Bcl-2蛋白的表达，同时增加 Bax的表达，且随着浓度的增加增加/抑制的效果更加明显。实验结果显示芹菜素诱导膀胱癌 5637细胞凋亡的机制可能与上调 Bax和下调 Bcl-2的表达，导致 Bcl-2/Bax比值下降，从而诱导细胞凋亡。

［1］韩苏军，张思维，陈万青，等.中国膀胱癌发病现状及流行趋势分析［J］.癌症进展，2013，11（1）：89-95.

［2］陈梓甫.表浅膀胱癌的诊断与治疗 ［J］.临床泌尿外科杂志，2003，18 （5）：257-258.

［3］樊晓栋，姜庆，王家武.新辅助化疗对肌层浸润性膀胱癌预后影响的Meta分析 ［J］.第三军医大学学报，2011，33（2）：196-199.

［4］Singh，C，K.，George，J.，Ahmad，N.Resveratrol-basedcombinatorial strategiesforcancermanagement.AnnNYAcadSci2013，1290，113 -121.

［5］孙斌，瞿伟菁，张晓玲.芹菜素的药理作用研究进展 ［J］.中药材，2004，27（7）：531-534.

［6］王海娣，刘艾林，杜冠华.芹菜素药理作用的研究进展 ［J］.中国新药杂志，2008，17（18）：1561-1565.

［7］胡太平，曹建国.芹菜素诱导人胃癌细胞凋亡作用及机制研究 ［J］.国际病理科学与临床杂志，2007，27（1）：6-10.

［8］朱峰，刘新光，梁念慈.大黄素，芹菜素抑制人卵巢癌细胞侵袭的体外实验研究 ［J］.癌症，2003，22（4）：358-362.

［9］孟勇，马清涌，马涛，等.芹菜素对人结肠癌细胞 SW480增殖抑制作用的实验研究 ［J］.现代肿瘤医学，2008，16（5）：701-703.

［10］金雪瑛，任常山.芹菜素抑制人乳腺癌 MDA—MB-231细胞血管内皮生长因子表达 ［J］.中国现代医学杂志，2007，17（4）：402-405.

［11］文红波，曹运长，董晓英，等.芹菜素诱导人肝癌 HepG2细胞分化［J］.湖南师范大学学报（医学版），2007，4（3）：6-9.

［12］刘杰，刘飞，夏红，等.芹菜素通过组成性激活 JNK敏化 TRAIL诱导HeLa细胞凋亡 ［J］.中国现代医学杂志，2011，21（25）：3095 -3100.

［13］陈宁，叶丽红.芹菜素抑制肿瘤细胞增殖机制研究进展 ［J］.环球中医药，2014，7（2）：151-154.

［14］Naseri，M.H.，Mahdavi，M.，Davoodi，J.，et al.Up regulation of Bax and down regulation of Bcl2 during 3-NC mediated apoptosis in human cancer cells［J］.Cancer Cell Int2015，15，55.

［15］Kondo，K.，Obitsu，S.，Ohta，S.，et al.Poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）-1-independent apoptosis-inducing factor（AIF）release and cell death are induced by eleostearic acid and blocked by alpha - tocopherol and MEK inhibition［J］.J Biol Chem 2010，285，（17），13079 -91.

Mechanism of apigenin on apoptosis of human bladder cancer 5637 cells

XIE Yangchun DENG Yongcheng TIAN Li Guangdong Provincial Shenzhen City Pingshan District Pepole′s Hospital，Shenzhen，518118，China

Objective To study the mechanism of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637.Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin，and MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates.The expressions of apoptosis-related proteins Bax，Bcl-2 and PARP were analyzed by Western blotting.Results Apigenin causes concentration-dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells.Western blotting demonstrated that apigenin increased the protein levels of Bax and PARP cleavage and reduced the protein expression of Bcl-2.Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells possibly by up-regulating the Bax expression，enhancing PARP cleavage，downregulating the Bcl-2 expression and resulting in the Bcl-2/Bax ratio decreased.

Apigenin；Bladder cancer；Apoptosis；Mechanism

R285.5

A

1007-8517（2016）14-0025-04

2016.05.03）

广东省深圳市龙岗区科技计划医疗卫生 （扶持类）基金 （编号：201406113001012）

?

谢杨春（1979-），男，硕士，主治医生，从事中医药治疗泌尿科疾病相关研究工作。E-mail：xieyc123@163.com