hTERT mRNA在肺癌中的作用△

李献文　仇铁峰　丁明　金建华江苏大学附属武进人民医院肿瘤内科，呼吸内科，江苏常州00江苏大学附属医院呼吸内科，江苏常州00

hTERT mRNA在肺癌中的作用△

李献文1仇铁峰2#丁明3金建华1
江苏大学附属武进人民医院1肿瘤内科，2呼吸内科，江苏常州213002
3江苏大学附属医院呼吸内科，江苏常州212002

目的探讨人端粒酶逆转录酶（human telomeraseReverse transcriptase，hTERT）在肺癌患者外周血微转移中的诊断价值。方法选取确诊为非小细胞肺癌（NSCLC）的患者40例，选择同期诊断为肺部良性疾病的患者20例为研究对象，在未进行任何治疗前收集各研究对象的外周血，实时荧光定量PCR方法检测血hTERT mRNA并进行评价分析。结果①NSCLC患者外周血中hTERT mRNA相对表达量明显高于肺良性疾病患者（P<0.05）；②40例NSCLC患者外周血中hTERT mRNA的阳性表达率分别为58.2%，20例肺良性疾病患者hTERT mRNA阳性表达率为5%，明显低于肺癌组患者（均P＜0.001）；③经分析，患者的hTERT mRNA与肺癌分期（TNM）具有显著的关系（P=0.004），但是，患者的年龄、性别、吸烟、肿瘤的组织学类型及分化程度对hTERT mRNA的表达无明显相关性。结论外周血hTERT mRNA表达在肺癌细胞分子标志物的NSCLC临床诊断中具有潜在的应用价值。

肺癌；hTERT

Key worddss::lung cancer;hTERT

Oncol Prog,2016,14(1)

肺癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤，且呈急剧上升趋势。其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌的80%，小细胞肺癌（SCLC）约占20%[1]。至2014年全球每年新增肺癌患者人数已达120万，我国肺癌发病率每年增长26.9%，且自诊断为肺癌后，其5年生存率﹤15%[1-2]。虽然手术是治疗NSCLC的主要方法，但65%的NSCLC患者在诊断时已存在远处转移，而20%的患者无转移[3]。其中，Ⅰ期NSCLC患者中有30%～40%的患者接受根治性手术治疗后均出现不同程度的复发状况，并且最终导致死亡[4-5]。经专家分析可知，其死亡?原因为癌细胞扩散至其他内脏所致。

肺癌预后生物学因子，即肿瘤标志物在肺癌中已展开了广泛研究，但仍未形成定论。端粒是维持真核系染色体末端完整及防止其异常的结构。人端粒酶是由人端粒酶RNA，其相关蛋白和hTERT共同构成。端粒酶存在于端粒的合成过程中，它是一种特殊的逆转录酶，TTAGGG的合成就是依靠这种端粒酶进行合成的，其编码基因主要位于3q26.3位置。端粒酶不仅作为一种逆转录酶而存在，且它在催化hTERT等方面还存在着显著的作用。所以本研究就hTERT mRNA在肺癌中的作用进行深入的探讨，以便为临床提供指导，现报道如下。

1　资料与方法

1.1病例资料

选取自2011年7月至2012年6月于江苏大学附属医院确诊为NSCLC的患者40例作为肺癌组。肺癌组患者中，男性25例，女性15例，年龄为42～80岁，平均年龄65岁；年龄≥60岁的患者有25例，﹤60岁的患者有15例。对肺癌组40例患者采用国际抗癌协会2009年修订的肺癌TNM分期标准进行评定，评定结果为：Ⅰ～Ⅱ期患者23例，Ⅲ～Ⅳ期患者17例。根据病理类型分为鳞癌患者29例，腺癌患者11例。低分化癌患者14例，中高分化癌患者26例。患者吸烟数量≥600支/年的患者23例，患者吸烟数量﹤600支/年的患者17例。本研究患者均无接受过任何药物治疗，在此抽取患者的外周血作为检测标本进行检测。

另外，在确定肺癌组患者的同时，选取20例肺部具有轻微病变（主要包括一些轻微的炎症等病变，其中肺炎7例，慢性支气管炎6例，结核性胸膜炎4例，脓胸、气胸、肺结节病各1例）的患者作为肺部良性疾病组。该组患者中，有男性14例，女性6例，年龄18～75岁，平均年龄55岁，此组患者无癌变现象。

1.2方法

1.2.1总RNA提取及cDNA合成总RNA提取：在患者空腹状态下抽取患者4 ml外周血，在抽取的新鲜外周血中加入EDTA-Na进行抗凝。采取密度梯度离心分离的方法将淋巴细胞分离出来。进而将分离好的分离液在无RNase的条件下采用Trizol试剂对其进一步地提取分离，最终提取的RNA为总RNA。采用紫外分光光度计检测RNA中的R值，根据公式A260/A280计算出RNA的总浓度。采用Fermentas公司生产的逆转录试剂盒中的合成要求对cDNA进行合成，并且将得到的总RNA与合成的cDNA在-20℃的冰箱中进行保存。

1.2.2实时荧光定量PCR反应根据上海生工生物工程有限公司设计及合成引物序列如下：β-actin F（5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'），β-actinR（5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'）；hTERT F（5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'），hTERTR （5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'）。荧光定量检测：在10 μl的反应体系中进行反应；反应条件：在95℃的高温条件下进行预变性30 s，该操作循环进行40次（95℃变性6 s、58℃退火15 s、74℃延伸25 s）；溶解条件：在95℃的高温条件下进行溶解60 s、在58℃的高温条件下进行高温溶解25 s、在95℃的高温条件下进行溶解30 s。

1.2.3荧光定量PCR产物鉴定步骤：hTERT PCR的产物取5 μl，6×loading Buffer混匀，将该产物加样在2%琼脂糖凝胶上进行混合，通100 V的恒压进行电泳30 min，最后采用EB染色，取染色片在凝胶成像系统下摄片，观察条带。

1.3统计学处理

相对定量值计算公式：2-△△Ct。△Ct为样本和内参△Ct均值，△△Ct=△Ct（-对照组Ct均值-改组内参Ct均值）。本研究采用2-△△Ct表示cDNA中包含的所要检测的基因含量。应用SPSS16-.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（）表示，两组之间mRNA测定值的比较采用t检验，计数资料比较采用Fisher’s Exact Test检验，以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1hTERT mRNA实时荧光定量扩增曲线

肺癌患者外周血中hTERT mRNA（图1），当Ct水平≤36时，其荧光定量的扩增曲线呈典型的S形曲线，溶解曲线也会呈现为单峰相。而肺部良性疾病组标本，Ct水平>36时也未见典型S形波形，即使扩增40个循环也没有典型S形曲线出现，多为略有翘起的不规则波浪线。

图1　部分患者标本的hTERT mRNA实时荧光定量扩增曲线

2.2hTERT荧光定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

肺癌组患者hTERT mRNA的阳性表达率分别为58.2%，部分标本高表达hTERT mRNA，而肺部良性疾病组基本不表达hTERT mRNA，阳性表达率仅为5%，明显低于肺癌组患者（P﹤0.001，图2），所得的条带大小和定量结果是基本一致的。

图2　各组外周血hTERT扩增结果

2.3 hTERT mRNA在两组患者外周血中的相对表达量

hTERT mRNA在两组患者外周血中的相对表达量不同，在NSCLC患者中的表达量为（3.02± 0.12），而肺良性疾病患者表达量为（2.43±1.12），两组的表达量差异具有显著统计学意义（t=-4.562，P ﹤0.05）。

2.4外周血hTERT mRNA与临床特征的关系

外周血hTERT mRNA的阳性例数与年龄、性别、吸烟与否、组织类型、分化层度无显著差异，仅与临床分期方面具有显著差异，差异具有统计学意义（P﹤0.05）。（表1）

3　讨论

在肺癌治疗过程中，常见的临床问题是出现局部和远处转移，且转移是患者预后不良的主要原因。如果能在早期评估其预后状况并采取相应的治疗措施，那么肺癌的病死率可能会大大降低。Pellatt等[6]提出血循环中的生物标志物对肿瘤风险评估、治疗效果和肿瘤复发均有监测作用。研究人员正在试图采取非侵入性方式从标本，如血浆、痰液中找到肿瘤标志物，以期在早期诊断和随访患者时，及时对肿瘤风险评估。检测发现，患者的肿瘤组织中、血循环中均存在异常的DNA[7]。

癌症的发展是一个复杂的过程，涉及基因和一些演变过程，其最终是由于细胞的再生与凋亡发生失调的结果。因此，维持正常的组织细胞处于平衡状态，可以有效地减少癌症的发生，端粒酶在维持细胞平衡方面起着重要的作用。对于健康人类，端粒酶活动只能在生殖细胞、造血细胞、激活淋巴细胞和其他潜在的增殖细胞中被发现[8]。但是在肿瘤细胞中可以发现大量的端粒酶[9]。此外，80%的NSCLC患者中可检测到端粒酶活性[10]，且和TNM分期密切相关。病情进展较快的肺癌患者具有较高的端粒酶活性[10]。本实验荧光定量PCR结果证明，hTERT mRNA在肺癌患者外周血中的表达率较高，并且癌症的TNM分期与其表达层度具有显著关系，但是hTERT mRNA的表达与患者的年龄、性别、吸烟、肿瘤的组织学类型及分化程度方面无明显相关性。综上所述，端粒酶的激活是肺癌过程中的一个关键步骤，与肺癌TNM分期相关，因此可以作为早期肺癌患者的分子标志物，对肿瘤的早期诊断、风险评估提供帮助，但是其与肿瘤进展及预后的相关性仍需进一步探索。

表1　外周血hTERT mRNA与临床特征的关系

[1]刘险峰,孙鲁山,杨治国.hTERT mRNA联合CYFRA21-l、NSE在肺癌检测中的应用研究[J].医学检验,2012,12 (23):123-126.

[2]何文武,黄国雄,胡松,等.非小细胞肺癌PITX1与hTERT mRNA表达相关性分析[J].中华肿瘤防治杂志,2013,20 (13):757-759.

[3]丁明,仇铁峰,李献文,等.hTERT、Skp2、TTF-1mRNA联合检测在非小细胞型肺癌早期诊断中的意义[J].广东医学,2015,36(10):1523-1525.

[4]谢学成,邱海,汤帆,等.端粒酶逆转录酶在结直肠癌组织中的表达及其临床意义[J].中国癌症防治杂志,2014,6 (3):252-255.

[5]SiegelR,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013 [J].CACancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[6]Pellatt AJ,WolffRK,Herrick J,et al.TERT'sRole in colorectal carcinogenesis[J].Mol Carcinog,2013,52(7): 507-513.

[7]魏晓军,白雪,聂玉辉,等.T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测结直肠癌循环肿瘤细胞hTERT与临床病理的关系[J].临床军医杂志,2012,40(4):846-848.

[8]刘少平,方春华,胡亚华,等.结直肠癌及癌前病变组织中hTERT表达及其临床意义[J].临床消化病杂志,2014,26 (2):83-86.

[9]闫洪生,侯英扑,丁玉珀,等.IGFBP-3基因mRNA表达水平在胶质母细胞瘤患者预后评价中的意义[J].临床肿瘤学杂志,2015,20(10):879-881.

[10]Yang CH,Yue J,Pfeffer SR,et al.MicroRNA-21 promotes glioblastoma tumorigenesis by down-regulating insulin-like growth factor-binding protein-3(IGFBP3)[J].J Biol Chem,2014,289(36):25079-25087.

TheRole of hTERT mRNAin lung cancer△

LI Xian-wen1QIU Tie-feng2#DING Ming3JIN Jian-hua11
Department of Medical Oncology,2Respiratory Medicine,Wujin Affiliated Hospital of Jiangsu University,Changzhou 213002,Jiangsu,China3Department ofRespiratory Medicine,Affiliated Hospital of Jiangsu University,Changzhou 212002,Jiangsu,China

ObjeccttiivveeTo investigate the diagnostic value of human telomeraseReverse transcriptase(hTERT)micrometastases in peripheral blood of patients with lung cancer.MeetthhooddThe peripheral blood sample of 40 cases of NSCLC lung cancer,and 20 cases of benign lung lesions were collected before startingRespective treatment,and theReal-time PCR method was applied to detect and evaluate the hTERT mRNA.Reessuulltt(1)TheRelative mRNA expression level of hTERT in NSCLC patients were significantly higher than those in benign lung disease patients(P<0.05).(2)The positiveRate of mRNA expression of hTERT in peripheral blood from 40 patients with NSCLC were 58.2%,while that of hTERT expression in peripheral blood from patients with benign lung disease were 5%,which was markedly lower compared with NSCLC patients(P<0.001).(3)For patients with NSCLC,the tumor TNM stage was significantly correlated with positiveRate of hTERT mRNA expression(P=0.004),whereas there were no correlations between the positiveRate of hTERT mRNA expression and age,gender,smoking,histopathlogical type and tumor cell differentiation degree.Coonncclluu--ssiioonnThe hTERT mRNAexpressions in peripheral blood could be used as a molecular marker for diagnosis of NSCLC.

R563

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.01.20

常州市科技计划项目（CY2011901）#

（corresponding author），邮箱：qiutiefeng@163.com

2015-11-17）