三七总皂苷对子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

谭宏伟　楚光华　胡春艳　张恩娣西北妇女儿童医院妇科，陕西西安　710061

三七总皂苷对子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

谭宏伟楚光华胡春艳张恩娣
西北妇女儿童医院妇科，陕西西安710061

目的 探讨三七总皂苷（PNS）对子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其作用机制。方法 应用不同浓度的PNS分别作用于Ishikawa和HEC-1A细胞24、48、72 h，采用MTT法检测细胞增殖率；Transwell检测细胞侵袭能力；流式细胞仪检测细胞凋亡水平；采用RT-PCR和Western blot分别检测VEGF、PI3K、AKT的mRNA和蛋白表达水平。 结果PNS可以显著抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖。与control组比较，PNS处理的Ishikawa和HEC-1A细胞侵袭显著下降（P＜0.05），细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），VEGF和PI3K的表达水平下降（P＜0.05）。结论PNS能够抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖和侵袭，诱导细胞凋亡，其过程可能与VEGF/PI3K/AKT信号通路的抑制有关。

三七总皂苷；子宫内膜癌；血管内皮生长因子；PI3K/AKT信号通路

［Abstract］Objective To investigate the effects of Panaxnotoginsengsaponins（PNS）on the cell proliferation，invasion and apoptosis in endometrial cancercell line Ishikawa and HEC-1A and its underlying mechanism.Methods Ishikawa and HEC-1A cells were treated with different density of PNS for 24，48，72 h.The MTT method was used to detect the cell proliferation rate after Ishikawa and HEC-1A；cell invasion ability was detected by Transwell method；cell apoptosis was measured by flow cytometry；the mRNA and protein expression level of VEGF，PI3K and AKT were detected by RT-PCR and Western blot，respectively.Results PNS could significantly inhibited the cell proliferation of Ishikawa and HEC-1A cells.Compared with control group，the cell invasion ability of Ishikawa and HEC-1A apparently decreased（P＜0.05），and the cell apoptosis were elevated with PNS treatment（P＜0.05），the expression of VEGF and PI3K decreased with PNS treatment（P＜0.05）.Conclusion PNS inhibits the proliferation，invasion and induces apoptosis in Ishikawaand HEC-1A cells，which may be related to the inhibition of VEGF/PI3K/AKT signaling pathway.

［Key words］Panaxnotoginsengsaponins；Endometrial cancer；Vascular endothelial growth factor；PI3K/AKT

子宫内膜癌是三大妇科恶性肿瘤之一［1-2］。目前子宫内膜癌的治疗方法较多，以手术和放疗为主，辅助化学治疗或激素治疗，然而化学及激素治疗存在明显的复发症和毒副作用［3-4］。因此，寻找高效、安全、使用范围广的子宫内膜癌治疗新药是现今的研究热点。三七总皂苷（panaxnotoginsengsaponins，PNS）三七的主要有效成分，具有扩张血管、降低血脂和抗炎等药理作用［5-6］。已有研究表明，PNS对多种癌细胞的增值、凋亡和代谢等有影响［7-10］。但PNS在子宫内膜癌中的作用还未见报道。本研究拟以子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞系为细胞模型，探讨PNS对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响，并探讨其分子机制，为PNS治疗子宫内膜癌的临床应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1细胞培养

Ishikawa和HEC-1A细胞（American Type Culture Collection，ATCC）用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL链霉素的 DMEM培养基置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2MTT法检测细胞增殖率

细胞以6×104个/孔接种置96孔板，应用不同浓度的PNS（50、100、150、200 μg/mL）（西安飞达生物公司）分别作用于Ishikawa和HEC-1A细胞24、48、72 h。弃去原培养液，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，37℃培养4 h。弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min使结晶充分溶解，于酶标仪上检测各组细胞吸光度值（A490），细胞增殖率=处理组A490/对照组A490×100%。

1.3Transwell法检测细胞侵袭

以正常培养的子宫内膜癌细胞为对照，以200μg/mL 的PNS处理的细胞为实验组。在Transwell上室聚碳酸酯膜上涂70 μL 1 mg/mL的matrigel胶，在37℃下静置60 min使其在微孔滤膜上重组为基底膜。胰酶消化待测细胞，收集细胞悬液后在离心半径为10 cm的离心机中1000 r/min离心5 min。重悬细胞后接种于Transwell上室内，并于下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培养液500 μL，孵育24 h。随后将滤膜上层的细胞用棉签抹去，用甲醇固定滤膜，Giemsa染色15 min。于200倍光镜下计算迁移到下层的细胞数量。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡

将待测细胞以2×105/孔的密度接种置6孔板，消化细胞，离心后弃去上清液收集细胞。PBS洗涤后离心弃上清液收集细胞，每孔加入100 μL结合缓冲液缓慢吹打，在悬浮细胞中分别加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI进行染色，摇匀后置于闭光孵育15 min。每管再加入400 μL结合缓冲液，于1 h内用流式细胞仪检测。

1.5RT-PCR检测mRNA表达

Trizol法提取待测细胞的总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度，逆转录成cDNA后PCR扩增。取5 μL扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，自动凝胶成像分析仪分析。实验结果以目的基因灰度值/内参灰度值表示。

1.6Western blot检测蛋白的表达

细胞用0.05%胰蛋白酶消化后，PBS洗涤3次。加入65 μL RIPA细胞蛋白裂解液裂解细胞，随后进行SDS-PAGE蛋白电泳分离蛋白。电转膜后用5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h，加入相应蛋白鼠抗一抗（Pierce，Rockford，USA），4℃轻摇过夜。随后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1 h。最后用X线胶片曝光分析，结果用Image-Pro Plus处理。蛋白的相对表达量以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示。

1.7统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1PNS抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的生长

PNS能显著抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖，同一浓度下，随着PNS作用时间的延长细胞的增殖抑制率亦明显升高（P＜0.05）；并且随着PNS浓度增加，增殖抑制率明显升高（P＜0.05）。后续实验采用200μg/mL PNS处理进行。见图1。

图1　三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞增殖的影响

2.2PNS抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的侵袭

经 200 μg/mL PNS处理 48 h后，Ishikawa和HEC-1A细胞的侵袭显著降低（P＜0.05）。见图2。

图2　三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞侵袭能力的影响

2.3PNS诱导子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的凋亡

PNS处理48 h后，Ishikawa细胞的凋亡率升高至21.0%，HEC-1A的凋亡率升高至20.2%，与control比较，细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）。见图3。

2.4PNS抑制VEGF的mRNA和蛋白表达

分别检测Ishikawa和HEC-1A细胞中VEGF的mRNA和蛋白。与control比较，PNS组的VEGF mRNA和蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图3　三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞凋亡的影响

图4　三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞中VEGF mRNA和蛋白表达的影响

2.5PNS抑制PI3K/AKT信号通路蛋白表达

与control比较，p-AKT的mRNA、蛋白表达水平在PNS组中显著降低 （P＜0.05），AKT的mRNA、蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。如图5所示，

图5　三七总皂苷对Ishikawa和HEC-1A细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响

3　讨论

现今全球每年新发子宫内膜癌约14万例，死亡人数约4万人/年［11］。中药因其较高的安全性在癌症的治疗中起重要作用［12］。PNS影响女性生殖恶性肿瘤细胞的增殖及凋亡［7，13-14］。但目前关于PNS对子宫内膜癌的作用还未见报道。本研究发现，PNS能显著抑制体外培养的子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖和侵袭，促进其凋亡，提示PNS对子宫内膜癌可能具有一定治疗作用。

目前中药抗子宫内膜癌的研究主要从抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤侵袭等方面展开。Wang等［7］研究证明PNS对乳腺癌细胞的侵袭和转移能力有抑制作用。Wang等［15］研究表明，PNS可以通过降低结直肠细胞的增殖，诱导细胞凋亡。本研究结果表明，PNS能显著抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖，并且其抑制作用具有浓度、时间的依赖性，随着PNS浓度的增加和作用时间的延长，细胞的增殖抑制也明显增高。并且PNS可以有效抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的侵袭能力，对细胞的凋亡也有一定促进作用。以上结果表明，PNS能够抑制子宫内膜癌细胞的生长和侵袭，并诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

近年来大量研究表明，VEGF是作用最强、特异性最高的调控因子，在肿瘤血管生成的各个环节中起到重要作用［16-17］。抑制VEGF可以达到抑制肿瘤血管新生并阻止肿瘤生长转移的目的［18］。已有研究表明PNS可以通过降低VEGF的表达降低动脉粥样硬化的血管新生［16］。本研究结果表明在PNS处理Ishikawa 和HEC-1A细胞中，VEGF的表达显著下降，提示PNS可能通过抑制VEGF影响子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和凋亡。

PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的信号转到通路之一，其异常激活与妇科肿瘤的发生、发展和转移等密切相关［19］。研究表明VEGF可以通过激活PI3K/ AKT信号通路促进子宫内膜癌细胞的增生及转移［20］。本研究结果发现PNS处理抑制PI3K/AKT信号通路在的Ishikawa和HEC-1A中的表达，与VEGF的表达趋势一致，说明PNS可能通过抑制子宫内膜癌细胞VEGF的表达，遏制PI3K/AKT信号通路激活。

综上所述，本研究表明PNS能够抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A的增殖和侵袭，并促进细胞的凋亡，其过程可能与VEGF/PI3K/AKT信号通路的抑制有关。在以后的研究中应进一步对PNS在子宫内膜癌中的作用机制进行深入研究，为提高患者的治愈率和生存率，开发临床有效新型治疗药物提供思路。

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Effects of Panaxnotoginsengsaponins on proliferation，invasion，apoptosis of endometrial cancercell lines Ishikawa and HEC-1A

TAN HongweiCHU GuanghuaHU ChunyanZHANG Endi
Department of Gynaecology，Northwest Women and Children Hospital，Shaanxi Province，Xi'an710061，China

R737.33

A

1673-7210（2016）05（b）-0013-04

谭宏伟（1971-），男，硕士，副主任医师；研究方向：妇科肿瘤以及妇科腹腔镜微创技术。

张恩娣（1953-），女，主任医师；研究方向：妇科肿瘤。

2016-02-15本文编辑：苏畅）