灰树花多糖D组分对细颗粒物诱导的人支气管上皮细胞损伤的保护作用

茹　琴　熊　琪　田　香　陈　琳　徐丛玥　李超英，2▲.湖北省江汉大学武汉生物医学研究院，湖北武汉　430056；2.湖北省汉济生物科技（武汉）有限公司，湖北武汉　430075

灰树花多糖D组分对细颗粒物诱导的人支气管上皮细胞损伤的保护作用

茹琴1熊琪1田香1陈琳1徐丛玥1李超英1，2▲
1.湖北省江汉大学武汉生物医学研究院，湖北武汉430056；2.湖北省汉济生物科技（武汉）有限公司，湖北武汉430075

目的 研究灰树花多糖D组分（D-fraction）对细颗粒物（SRM 2786）诱导的人支气管上皮细胞（16HBE）损伤的保护作用。方法 利用细胞增殖实验检测SRM 2786或D-fraction对16HBE细胞增殖的影响，确定给药浓度；将16HBE细胞分7组，分别为对照组、模型组（125 μg/mL SRM 2786）和不同浓度D-fraction给药组（分别给予12.5、25、50、100、200 μg/mL D-fraction，同时给予125 μg/mL SRM 2786），细胞增殖实验检测细胞存活率，酶联免疫法检测细胞培养液白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）的含量。结果31.25～500 μg/mL SRM 2786处理使细胞存活率显著降低（P＜0.05）。125 μg/mL的SRM 2786刺激使16HBE细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和GM-CSF释放显著升高（P＜0.05），D-fraction（≥100 μg/mL）显著抑制SRM 2786诱导的炎症细胞因子释放（P＜0.01），且能显著提高损伤细胞存活率。结论 细颗粒物能抑制16HBE细胞增殖、诱导炎症因子释放，D-fraction对细颗粒物造成的细胞损伤有显著保护作用，其作用机制可能与抑制炎症因子释放有关。

细颗粒物；炎性损伤；灰树花多糖D组分；人肺支气管上皮细胞

［Abstract］Objective To investigate the protective effect of Grifola frondosa D fraction（D-fraction）on human bronchial epithelial（16HBE）cell damage that induced by fine particulate matter（SRM2786）.Methods MTT assay was used to detect the survival rate of 16HBE cells treated with SRM2786 or D-fraction，and the concentration of SRM2786 or D-fraction used for further experiments was selected.16HBE cells were divided into seven groups，including control group，model group（125 μg/mL SRM 2786），D-fraction group（125 μg/mL SRM 2786+12.5 or 25 or 50 or 100 or 200 μg/mL D-fraction）.MTT assay was used to detect the survival rate，and enzyme-linked immune kits were used to detect the release of interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（GM-CSF）.Results Compared with the control group，the cell survival rates of 16HBE cells treated with SRM 2786（31.25-500 μg/mL）were decreased remarkably（P＜0.05）.Treatment with 125 μg/mL SRM 2786 could significantly increase the release of IL-1β，IL-6，TNF-α and GM-CSF（P＜0.05）.D-fraction（≥100 μg/mL）could not only significantly improve the survival rate，but also significantly inhibit the release of inflammatory cytokines（P＜0.01）.Conclusion Fine particulate matter can inhibit cell proliferation and induce the release of inflammatory cytokines.D-fraction has a significant protective effect of cell damage caused by fine particulate matter，and the mechanism may be related to inhibit the release of inflammatory factors.

［Key words］Fine particulate matter；Inflammation damage；Grifola frondosa D-fraction；Human lung bronchial epithelial cells

细颗粒物（fine particlate matter，空气动力学直径≤2.5 μm的颗粒）是雾霾中的首要污染物［1］，不易被鼻腔绒毛阻挡，能抵达细支气管壁，引发哮喘、支气管炎和心血管病等疾病［2］。细颗粒物浓度每增加10 μg/m3，总死亡风险会上升4%，心肺疾病死亡风险上升6%，肺癌死亡风险上升8%［3］。

细颗粒物通过刺激肺泡巨噬细胞和支气管上皮细胞，诱发炎症导致呼吸道局部免疫力下降和肺上皮细胞纤维化［4］。Veronesi等［5］发现细颗粒物使人支气管上皮细胞中Ca2+升高，白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-8（IL-8）等释放增多，推测细颗粒物中的酸性可溶成分通过辣椒素和pH敏感受体途径刺激细胞因子释放。此外，细颗粒物通过刺激血小板生长因子与转化生长因子的产生，引起气道壁纤维组织增厚，导致增生性炎症发生［6］。

灰树花（grifola frondosa）是一种药食兼用珍稀真菌。自20世纪80年代始，国内外学者从灰树花子实体和菌丝体中提取了几十种活性多糖，包括D-组分、MD-组分、X-组分等［7］。其中D-组分（D-fraction）是1984年日本学者Nanba提取的酸不溶性组分，含有以β-（1-6）结合为主链、β-（1-3）结合为侧链的葡聚糖和以β-（1-3）结合为主链、β-（1-6）结合为侧链的葡聚糖。D-fraction不仅能增强正常小鼠免疫功能［8］，还能通过提高免疫功能抑制肿瘤生长［9］。然而，D-fraction是否对细颗粒物引起的支气管上皮细胞损伤具有保护作用，目前尚无文献报道。本实验研究D-fraction对细颗粒物诱导的人支气管上皮细胞（16HBE）损伤的保护作用，为细颗粒物的毒性机制研究以及新功能食品的开发等提供科学依据。

1　材料与方法

1.1试剂

RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶和青链霉素购自Gibco公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）购自Sigma公司；IL-1β、IL-6、TNF-α和粒细胞-巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）酶联免疫（ELISA）检测试剂盒购自美国Biosource公司；D-fraction购自美国MushRoom Wisdom公司；其余试剂均为分析纯。

1.2细胞系

16HBE细胞购自中国医学科学院肿瘤医院细胞库，用完全培养基（含10%FBS和100 U青链霉素的RPMI-1640培养基）于37℃、5%CO2培养。

1.3细颗粒物悬液制备

细颗粒物成分复杂，且随着季节不断变化，对肺细胞损伤的程度和机制也不同［10］，本实验选用的细颗粒物为美国国家标准与技术研究所提供的标准品SRM 2786，其成分分析报告可在官网查询［11］。实验所用细颗粒物悬液均为现用现配，将SRM 2786用完全培养基配成2000 μg/mL的储存液，超声振荡混匀后用完全培养基稀释成所需浓度。

1.4细胞分组

实验一中16HBE细胞分6组，分别加入不同浓度的SRM 2786（0、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL），细胞增殖实验检测细胞存活率，确定后续实验中SRM 2786浓度。实验二中16HBE细胞分10组，分别加入不同浓度的D-fraction（0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL），确定后续实验中D-fraction浓度。实验三中16HBE细胞分7组，分别为对照组、模型组（125 μg/mL SRM 2786）和不同浓度D-fraction给药组（分别给予12.5、25、50、100、200 μg/mL D-fraction，同时给予125 μg/mL SRM 2786），细胞增殖实验测定细胞存活率，ELISA检测细胞培养液中IL-1β、IL-6、TNF-α和GM-CSF的含量。

1.5细胞增殖实验

16HBE细胞消化后接种于96孔板中，细胞密度为1×104个/孔，37℃培养24 h，分别加入不同浓度处理物质，每个浓度设6个平行孔，同时设立无药对照孔和无细胞空白孔，37℃继续培养24 h。弃上清，每孔加入90 μL完全培养基和10 μL MTT溶液 （5 g/L），继续培养4 h。弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，酶标仪570 nm波长检测吸光度值（A），按下面公式计算细胞存活率T/C（%）：T/C（%）=（A样品组－A空白组）/ （A对照组－A空白组）×100%

1.6细胞因子含量测定

ELISA试剂盒检测各组细胞培养液中IL-6、IL-1β、TNF-α和GM-CSF含量。16HBE细胞消化后接种于24孔板中，细胞密度为1×105个/孔，37℃培养24 h。分别加入不同浓度处理物质，每个浓度设3个平行孔，同时设立无药对照孔，37℃继续培养24 h。收集上清，按照试剂盒说明书操作步骤检测各组细胞培养液中细胞因子含量。

1.7统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对数据进行统计分析，实验所得数据以均数±标准差（±s）表示，各组之间进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1SRM 2786对16HBE细胞增殖的影响

与对照组比较，31.25 μg/mL SRM 2786处理组细胞存活率显著降低（P＜0.05），62.5～500 μg/mL SRM 2786处理组细胞存活率极显著降低（P＜0.01），表明细颗粒物能显著抑制16HBE细胞增殖。见表1。

表1　SRM 2786对16HBE细胞增殖的影响（±s）

表1　SRM 2786对16HBE细胞增殖的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；SRM2786：细颗粒物；16HBE：人支气管上皮细胞

细胞存活率（%）对照组SRM2786处理组组别　SRM 2786浓度（μg/mL）吸光度值（A）0 31.25 62.5 125 250 500 0.38±0.01 0.29±0.01 0.24±0.01 0.24±0.01 0.22±0.02 0.20±0.01 100±1.28 76.30±1.57*62.02±1.68**61.41±0.79**57.06±2.06**52.70±1.66**

2.2D-fraction对16HBE细胞增殖的影响

D-fraction浓度在1.56～50 μg/mL范围内，对16HBE细胞增殖无明显影响（P＞0.05），在100～400 μg/mL范围内，细胞存活率与对照组比较显著增加 （P＜0.01），表明高浓度D-fraction（≥100 μg/mL）能显著促进16HBE细胞增殖。见表2。

表2　D-fraction对16HBE细胞增殖的影响（±s）

表2　D-fraction对16HBE细胞增殖的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；D-fraction：D组分；16HBE：人支气管上皮细胞

组别　D-fraction浓度（μg/mL）　吸光度值（A）　细胞存活率（%）对照组给药组0 1.56 3.125 6.25 12.5 50 100 200 400 1.67±0.15 1.55±0.16 1.59±0.35 1.71±0.35 1.85±0.34 1.81±0.12 1.88±0.23 2.32±0.29 2.50±0.27 100±4.76 95.71±10.78 102.62±10.47 110.98±10.33 108.65±3.70 112.89±6.89 139.58±8.85*150.13±8.05*184.26±12.40*

2.3D-fraction对SRM2786损伤的16HBE细胞增殖的影响

D-fraction对SRM2786造成的细胞损伤有一定保护作用，D-fraction浓度在25～200 μg/mL范围内，随着D-fraction浓度的升高，细胞存活率逐渐升高。见表3。

表3　D-fraction对SRM2786损伤的16HBE细胞增殖的影响（±s）

表3　D-fraction对SRM2786损伤的16HBE细胞增殖的影响（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01；D-fraction：D组分；SRM2786：细颗粒物；16HBE：人支气管上皮细胞

组别　SRM2786浓度（μg/mL）D-fraction浓度（μg/mL）吸光度值（A）细胞存活率（%）对照组模型组给药组0 125 125 125 125 125 125 00 12.5 25 50 100 200 1.77±0.02 0.93±0.02 0.97±0.01 1.33±0.07 1.50±0.04 1.59±0.05 1.60±0.12 100.00±1.15 53.10±1.06 54.67±0.29 75.09±3.92*84.60±2.04*90.05±2.61*90.22±7.05*

2.4D-fraction对SRM2786损伤的16HBE细胞细胞因子释放的影响

与对照组比较，125 μg/mL的SRM2786作用24 h后，16HBE细胞培养液中4种炎症因子含量均显著升高（P＜0.01）。D-fraction对SRM2786造成的炎症细胞释放有明显抑制作用，高浓度（100、200 μg/mL）D-fraction共处理组4种炎症因子均显著降低 （P＜0.01）。见表4。

表4　D-fraction对SRM2786损伤16HBE细胞细胞因子释放的影响（±s）

表4　D-fraction对SRM2786损伤16HBE细胞细胞因子释放的影响（±s）

注：与对照组比较，#P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；D-fraction：D组分；SRM2786：细颗粒物；16HBE：人支气管上皮细胞；IL-1β：白介素-1β；IL-6：白介素-6；TNF-α：肿瘤坏死因子

组别　SRM2786浓度（μg/mL）D-fraction浓度（μg/mL）IL-1β浓度（ng/mL）IL-6浓度（ng/mL）TNF-α浓度（ng/mL）GM-CSF浓度（ng/mL）对照组模型组给药组0 125 125 125 125 125 125 00 12.5 25 50 100 200 43.92±2.94 58.33±0.89#57.15±1.51 55.98±0.33*54.01±0.16**55.29±0.58**54.80±0.94**15.21±0.36 21.91±0.31#21.87±0.50 20.95±0.14 21.16±0.16 17.95±0.14**17.12±0.21**43.61±0.83 66.48±0.64#55.64±1.39**48.51±0.16**45.18±0.69**43.14±0.16**41.38±0.48**458.33±16.07 657.5±11.45#536.67±11.27**495.83±2.89**462.50±2.50**464.17±11.27**467.16±10.10**

3　讨论

流行病学调查显示细颗粒物的浓度与心肺系统疾病的发病率和死亡率存在密切关联［3］。体外实验显示细颗粒物能导致肺巨噬细胞凋亡［12］，显著抑制人肺成纤维细胞增殖，并诱导细胞DNA损伤［13］。本实验结果显示细颗粒物SRM 2786能显著抑制16HBE细胞增殖，细胞存活率随着细颗粒物浓度增加而降低，与前期研究结果一致［12-13］。

近年研究表明，D-fraction具有抗肿瘤及改善免疫功能的作用［15］，本实验结果显示高浓度D-fraction（≥100 μg/mL）对16HBE细胞增殖具有促进作用，还能显著提高细颗粒物损伤细胞的存活率，表明D-frac tion对细颗粒物造成的细胞损伤有显著保护作用。

颗粒物过度沉积对呼吸道产生刺激，使IL-1、IL-6释放增加，进而引起炎性细胞浸润，同时，颗粒物可导致气道上皮细胞及血管内皮细胞表达相关黏附分子，促进炎性细胞聚集，进一步加强呼吸系统炎性反应［15-16］。邵国军等［17］研究显示大鼠长期暴露于颗粒物环境后呼吸系统粘膜出现水肿、增生并有大量炎症细胞渗入，肺巨噬细胞能会通过分泌IL-6、TNF-α等吸引更多炎症细胞向颗粒物引起的炎症部位聚集。本研究结果显示，125 μg/mL细颗粒物刺激可使16HBE细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和 GM-CSF合成释放增加，表明细颗粒物对机体具有潜在炎性损伤毒性。D-fraction与细颗粒物共处理对细颗粒物造成的炎症细胞因子释放有明显抑制作用，其中高浓度（100、200 μg/mL）D-fraction组 4种炎症细胞因子均显著降低（P＜0.01），进一步表明 D-fraction是通过降低细颗粒物对16HBE细胞造成的炎性损伤而起到保护作用的。

综上所述，细颗粒物刺激可使人支气管上皮细胞细胞存活率降低，IL-1β、IL-6、TNF-α和GM-CSF4种炎症细胞因子释放增加，D-fraction与对细颗粒物造成的炎症细胞因子释放具有明显的抑制作用，能显著提高损伤细胞的存活率，表明D-fraction对细颗粒物造成的细胞损伤具有显著的保护作用，其作用机制可能与抑制炎症因子表达释放有关，为灰树花多糖在细颗粒物损伤防治研究提供实验基础。

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Protective effects of Grifola frondosa D fraction on human bronchial epithelial cells damage induced by fine particulate matter

RU Qin1XIONG Qi1TIAN Xiang1CHEN Lin1XU Congyue1LI Chaoying1，2▲
1.Wuhan Institutes of Biomedical Sciences，Jianghan University，Hubei Province，Wuhan430056，China；2.Hanjea Biological Technology（Wuhan）Co.，Ltd.，Hubei Province，Wuhan430075，China

R962

A

1673-7210（2016）05（b）-0021-04

2016-01-25本文编辑：赵鲁枫）