淫羊藿女贞子对糖皮质激素性骨质疏松大鼠糖皮质激素受体作用的影响

杨　燕　年宏蕾　刘仁慧，2　王秀娟.首都医科大学中医药学院，北京　00069；2.中医络病研究北京市重点实验室，北京　00069

淫羊藿女贞子对糖皮质激素性骨质疏松大鼠糖皮质激素受体作用的影响

杨燕1年宏蕾1刘仁慧1，2王秀娟1
1.首都医科大学中医药学院，北京100069；2.中医络病研究北京市重点实验室，北京100069

目的 研究淫羊藿女贞子煎剂及其有效成分提取物配伍对糖皮质激素性骨质疏松（GIOP）大鼠糖皮质激素（GC）及糖皮质激素受体（GR）的影响。方法 SPF级雄性SD大鼠60只，随机分为正常对照组（N组）、模型对照组（M组）、淫羊藿女贞子煎剂高、低剂量组（7、3.5 g/kg，YN高、低剂量组），淫羊藿女贞子提取物高、低剂量组（200、100 mg/kg，YNE高、低剂量组），每组10只。除N组外，大鼠两大腿内侧交替肌内注射地塞米松（1 mg/kg），每周2次，8周后，采用酶免法检测血清皮质酮（CORT）及GR含量，流式细胞术检测股骨GR蛋白表达量及结合力。结果与N比较，M组血清CORT及GR含量显著降低 （P＜0.01），股骨GR蛋白表达量及结合力显著升高（P＜0.01）。与M组比较，4个给药组均能显著增加血清CORT及GR含量（P＜0.01），下调股骨GR蛋白表达量（P＜0.01）；YN高剂量组与YNE高、低剂量组能显著降低股骨GR蛋白结合力（P＜0.01）。结论 淫羊藿女贞子抗GIOP的作用机制与抑制GR在骨组织的表达、降低GC对骨组织的作用有关。

骨质疏松；糖皮质激素；糖皮质激素受体；淫羊藿/女贞子

［Abstract］Objective To investigate the effects of combination of the decoction and active ingredients of Epimedii Folium and Fructus Ligustri Lucidi on glucocorticoid（GC）and its receptor（GR）in glucocorticoid-induced osteoporosis （GIOP）rats.Methods 60 male SD rats were randomly divided into 6 groups：the normal group（N group），the model group（M group），the decoction combination of Epimedii Folium and Ligustri Lucidi Fructus groups（7，3.5 g/kg，YN high dose group，YN low），and the extract combination groups（200，100 mg/kg，YNE high dose group，YNE low does group），each group had 10 rats.Except the N group，all rats received intramuscular injection of Dexamethasone（1 mg/kg）twice a week to establish osteoporosis model.After eight weeks，serum CORT and GR were detected by ELISA.The content and the binding force of GR in bone tissue were detected by flow cytometry.Results Serum CORT and GR in the M group were lower than the N group（P＜0.01），while the content and the binding force of GR in bone tissue were higher （P＜0.01）.Compared with the M group，the levels of serum CORT and GR increased in all the treatment groups（P＜0.01），while the expression of GR protein deceased in bone tissue（P＜0.01）.The binding force of GR in bone tissue reduced in the YN high dose group group（7 g/kg）and YNE high dose group，YNE low dose group（P＜0.01）. ConclusionThemechanismofthecombinationof Epimedii Folium and Fructus Ligustri Lucidi in treating GIOP may be related to the inhibition of GR expression in bone tissue and reducing the effect of GC on the bone.

［Key words］Osteoporosis；Glucocorticoid；Glucocorticoid receptor；Epimedii Folium/Fructus Ligustri Lucidi

糖皮质激素（glucocorticoid，GC）由于其良好而有效的抗炎、抗病毒、免疫等多种药理作用，被广泛应用于抗移免疫排斥、自身免疫疾病及肿瘤治疗等领域［1-2］。但长期大剂量使用GC治疗疾病同时会出现激素抵抗、激素依赖以及局部和全身性副作用。糖皮质激素性骨质疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是其引发的最严重副作用之一，发病率超过50%［3］。GC作用（包括药理作用及毒副反应）的发挥，主要是由糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）介导实现的［4］。基于中医对GIOP病机主要为“肾精不足，阴阳两虚”的认识，课题组前期应用“阴阳双补，益精壮骨”之淫羊藿女贞子配伍防治GIOP大鼠骨代谢异常具有良好的作用［5-6］。有研究表明，GR是阴虚、阳虚证的共性蛋白之一［7-8］，但其在GIOP发病中的变化尚未有研究报道。本研究主要通过观察淫羊藿女贞子配伍对GR及皮质酮 （corticosterone，CORT）的影响作用，探索淫羊藿女贞子煎剂及其提取物预防GIOP的保护机制，为中药防治GIOP提供理论基础。

1　材料与方法

1.1实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠60只，3月龄，体重（200±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2012-0001。SPF级动物环境，自由饮水、摄食。

1.2仪器

流式细胞仪（FACS Calibur，美国BD公司）；全自动多功能酶标仪（Multiskan MK3，美国THERMO公司）；电热恒温培养箱（DH6000II，天津泰斯特仪器有限公司）；低温离心机（Sigma3K15，北京五州东方科技发展有限公司）；电子天平（SQP，赛多利斯科学仪器北京有限公司）；漩涡振荡器（MH-1，其林贝尔仪器有限公司）。

1.3药品与试剂

淫羊藿总黄酮类提取物（批号：20150419，含总黄酮以淫羊藿苷计为80%，提取率约为2.5%）、女贞子黄酮和萜类提取物（批号：20150221，含量分别以齐墩果酸和芦丁计，总含量＞80%，提取率约为5%）（上海一林生物科技有限公司）；淫羊藿、女贞子中药材（北京同仁堂）；地塞米松磷酸钠注射液（国药集团容生制药有限公司，批号：1501408-C22）；地塞米松荧光素（Invitrogen，批号：1654506）；GR单克隆抗体（Abcam，批号：GR138021-1）；TRTIC标记荧光二抗（Abcam，批号：709239）；FITC-GR二抗（Abcam，批号：ab51379）；Ⅰ型胶原酶（Sigma）；0.25%胰蛋白酶消化液（凯基生物，批号：20150817）；大鼠血清CORT酶免试剂盒（美国BG公司，批号：20150918）；大鼠血清GR酶免试剂盒（美国BG公司，批号：20150918）。

1.4实验方法

1.4.1分组SD大鼠适应性喂养1周，按随机数字表法分为6组，每组10只。包括正常对照组（N组），模型对照组（M组），淫羊藿女贞子煎剂高（YN高剂量组）、低剂量组（YN低剂量组），淫羊藿女贞子提取物高（YNE高剂量组）、低剂量组（YNE低剂量组）。

1.4.2药物制备 淫羊藿水煎液：适量称取淫羊藿饮片，首煎加8倍体积的水浸泡1 h后加热煮沸，文火保持沸腾30 min，搅拌、趁热滤取药液；药渣再加原药量6倍的水加热煮沸，改文火续煎30 min后过滤，合并两次药液，浓缩至含生药0.35 g/mL，4℃保存。女贞子水煎液煎药方法同上。

1.4.3造模与给药参考文献［9］，除N组外，各组大鼠分别给予两大腿内侧交替肌内注射地塞米松1 mg/kg，每周2次，共计8周，N组大鼠给予等体积的生理盐水。造模的同时，各组动物给予相应的药物，YN高、低剂量组分别给予淫羊藿女贞子（4∶3）煎剂7、3.5 g/kg灌胃；YNE高、低剂量组分别给予淫羊藿女贞子有效成分提取物（2∶3）200、100 mg/kg灌胃；N组、M组，灌服等体积的生理盐水，每日1次。

1.4.4取材及检测大鼠禁食16 h后，腹腔麻醉，腹主动脉取血，离心取血清，按照试剂盒说明书，采用ELISA法检测血清CORT、GR含量。完整分离大鼠左侧股骨，剔除所附着的肌肉和结缔组织，用PBS冲洗2次，将骨片剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，无EDTA 0.25%胰酶37℃水浴消化20～30 min，吸弃上清，骨片加入0.1%Ⅱ型胶原酶，37℃水浴消化2次，每次1 h，收集上清，1000 r/min离心10 min，收集骨细胞沉淀。参考文献［10］，以流式细胞术检测骨组织GR蛋白表达量及GC-GR蛋白结合力。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较根据方差齐性检验结果选择LSD-t（方差齐）或Tamhane's T2（方差不齐）检验；相关分析采用Pearson相关法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠血清CORT及GR含量比较

与N组比较，M组血清CORT及GR含量均显著降低（P＜0.01）；与M组比较，4个给药组血清CORT 及GR含量均显著升高（P＜0.01）。此外，YN高剂量组血清GR含量较YN低剂量组显著升高 （P＜0.05）。见表1。

表1　各组大鼠血清CORT及GR含量比较（ng/mL，±s）

表1　各组大鼠血清CORT及GR含量比较（ng/mL，±s）

注：与N组比较，**P＜0.01；与M组比较，△△P＜0.01；与YN低剂量组比较，▲P＜0.05；CORT：皮质酮；GR：糖皮质激素受体

组别　只数　CORT　GR N组M组YN低剂量组YN高剂量组YNE低剂量组YNE高剂量组10 10 10 10 10 10 9.6161±1.0801 4.7301±0.3718**6.7198±0.9210△△7.6024±0.6251△△7.3974±1.0468△△7.7598±0.9358△△3.2654±0.3564 1.4068±0.1590**2.0154±0.1874△△2.6266±0.4087△△▲2.7887±0.3173△△3.2679±0.4155△△

2.2各组大鼠骨组织GR蛋白表达量及GR结合力的比较

与N组比较，M组大鼠骨组织GR蛋白表达量、GR蛋白结合力均显著升高（均P＜0.01）；与M组比较，4个给药组均能显著抑制骨组织GR蛋白表达量（P＜0.01或P＜0.05）；除YN低剂量组以外，其余3个给药组均能降低大鼠骨组织GR蛋白结合力（均P＜0.01）。见表2。

表2　各组大鼠骨组织GR蛋白表达量及GR结合力的比较（±s）

表2　各组大鼠骨组织GR蛋白表达量及GR结合力的比较（±s）

注：与N组比较，**P＜0.01；与M组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；CORT：皮质酮；GR：糖皮质激素受体

组别　只数　GR蛋白表达量　GR蛋白结合力N组M组YN低剂量组YN高剂量组YNE低剂量组YNE高剂量组666666 2007.17±457.56 3619.33±229.00**2870.50±656.99△2662.67±397.94△△2614.17±756.49△△2229.17±369.94△△3238.33±692.49 6465.33±418.45**5785.17±487.56 5534.50±789.18△△4826.83±579.88△△4347.00±435.92△△

2.3大鼠血清CORT、GR与骨组织GR的相关性分析

相关性分析显示：血清CORT含量与血清GR含量呈显著正相关（r=0.680，P＜0.01），与骨组织GR蛋白表达量和结合力呈显著负相关（r=-0.483、-0.559，均P＜0.01）；血清GR含量与骨组织GR蛋白表达量和结合力均呈显著负相关（r=-0.737、-0.753，均P＜0.01）；骨组织GR蛋白表达量和结合力呈显著正相关（r= 0.648，P＜0.01）。见表3。

表3　大鼠血清CORT、GR与骨组织GR的相关性分析（r值，n=36）

3　讨论

对于GIOP的防治，目前西医并没有理想药物，临床用药常借鉴原发性骨质疏松症（osteorosis pathology，OP）的治疗，大多数学者主张联合使用钙制剂和维生素D，但系统评价远期疗效（36个月后）不显著。中医认为GC为外源性“纯阳”“邪热”之品，长期服用，致火旺伤阴，日久累及肾阳，使肾中阴阳亏损，肾精亏虚无以充实骨骼，诱发OP［11-12］。针对GIOP的中医病机“肾精不足，阴阳两虚”，国家级名老中医李世增教授经多年临床经验筛选具有 “阴阳双补，益精壮骨”之功的淫羊藿女贞子药对，用于GIOP的防治，并取得良好的疗效。中药淫羊藿温补肾阳、强筋骨，为补阳药；女贞子滋补肝肾阴精、强腰膝，为补阴药，二药配伍，有“阴阳相济”之妙用。大量研究证实，淫羊藿抗OP作用与其所含的黄酮类物质有关［13-14］，女贞子抗OP的主要成分以黄酮类、萜类为主［15-16］。淫羊藿、女贞子均具有药用植物分布广、低毒副作用、价格合理、标本兼治、资源丰富、可长期服用等优点，且组方药味少，有效成分明确。因此，研究淫羊藿女贞子煎剂及其抗OP的有效成分防治GIOP的作用有着良好的开发和应用前景。

GC诱发OP的不良反应主要通过GR介导，抑制成骨细胞增殖分化，影响成骨细胞功能，促进成骨细胞凋亡，属于以骨形成减少为主要特点的低转换型OP类型［17-18］。GR的功能活性由GR的蛋白表达数量和GR的配体亲和力两方面因素决定，对于GR在GIOP发病中的变化目前尚未有文献报道。结合中医的现代研究观点“GR是肾阴、阳虚证的相关共性蛋白［19-20］”认识，本课题主要观察GIOP大鼠体内GR的变化，探讨淫羊藿女贞子煎剂及提取物对GIOP骨组织的保护机制。本实验采用流式细胞术检测骨组织GR蛋白表达量及结合力，结果显示，GIOP大鼠骨组织中GR蛋白表达量及GR结合力均显著升高（P＜0.01），提示外源性GC可诱导骨组织高表达GR，且GR与GC的结合敏感性增加。应用淫羊藿女贞子煎剂及提取物治疗，均能显著下调GIOP大鼠骨组织中GR蛋白表达及结合力（P＜0.01或P＜0.05）。骨中GR蛋白数量及功能的减弱，表明GC对骨组织作用的敏感性降低，防止GC在使用过程中对骨组织产生的不良危害。

文献研究表明，GC类药物的超生理剂量或长期应用可抑制肾上腺皮质功能［21-22］，致使机体内源性CORT分泌减少，GR功能减弱，本实验得出相似的结果。大鼠经8周地塞米松造模后，血清CORT、GR含量均显著降低（P＜0.01），出现GR功能的显著抑制，从而导致激素用药的敏感性降低及所发挥的抗炎等药理作用减弱。提示激素抵抗的出现，需要加大GC剂量才能够控制病情，甚至大剂量GC应用也不能奏效，反而导致一系列严重的副作用。而应用中药淫羊藿女贞子后，能显著增加GIOP大鼠血清CORT、GR含量（P＜0.01），提示药物能够保护内源性GC作用途径，恢复对激素的敏感性，从而可预防激素抵抗的发生，降低激素用量，这可能为临床大量相关免疫性疾病治疗中的激素应用及激素抵抗的预防提供了有益的启示。

GC对血中GR含量的影响主要与激素的药理作用有关，而对骨组织GR的影响作用则与诱导OP的发生有关。上述研究发现，GC长期应用能抑制血清GR含量，却上调骨中GR蛋白表达及结合力，提示GC长期应用，会导致其药理作用的敏感性降低，但对骨代谢的抑制作用反而增强。相关分析的结果提示，血清CORT含量与血清GR含量呈正相关（P＜0.01），但与骨组织GR蛋白表达量和结合力均呈显著负相关（P＜0.01）；血清GR含量分别与骨组织GR蛋白表达量及结合力呈负相关（P＜0.01）。进一步验证了当出现激素耐受时，虽然激素药理活性降低，但并不影响对骨代谢的副作用，GC诱导OP的副作用是持续进展的。

综上所述，中药淫羊藿女贞子煎剂及提取物通过抑制GR在骨组织中的表达，降低GC对骨的危害，防止GIOP的发生。同时，还能明显改善GC对内源性CORT、GR的抑制作用，提高激素作用的敏感性，从而对内源性的GC作用途径有良好的保护作用，减少激素用量，降低GIOP的发生。

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Effects of the combination of Epimedii Folium and Fructus Ligustri Lucidi on glucocorticoid receptor in glucocorticoid-induced osteoporosis rats

YANG Yan1NIAN Honglei1LIU Renhui1,2WANG Xiujuan1
1.School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing100069，China；2.Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Collateral Disease Theory Research，Beijing100069，China

R285.5

A

1673-7210（2016）05（b）-0004-04

国家自然科学基金资助项目（81373814）；北京市教育委员会科技计划面上项目（KM201510025012）；北京中医药薪火传承“3+3”工程二室一站建设项目（2012-SZ-C-42）。

杨燕（1993-），女，首都医科大学中医药学院2015级中药学专业在读硕士研究生；研究方向：中药及复方的药效及作用机制。

刘仁慧（1974-），女，副教授，博士，硕士生导师；研究方向：中药配伍及药效学研究。王秀娟（1956-），女，教授，博士生导师；研究方向：中药药效与作用机制。

2016-02-10本文编辑：程铭）