维科天然生物制剂对干酪乳杆菌生长影响的初探

李　丹,任晓静,陈　婷,奚印慈

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)



维科天然生物制剂对干酪乳杆菌生长影响的初探

李丹,任晓静,陈婷,奚印慈*

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

利用植物资源开发新的培养方法来促进干酪乳杆菌的生长。在单因素优化实验的基础上,采用响应面实验设计,首次对能缓解环境污染的维科(WIC)天然生物制剂影响干酪乳杆菌生长的条件进行初步优化。结果表明,维科天然生物制剂可以促进干酪乳杆菌的生长。经过响应面分析得到的最优促生长条件为:温度39.51℃,培养基起始pH6.16,接种量1.34%,最适维科制剂培养浓度12.56 mg/mL,干酪乳杆菌的实际OD610 nm值达2.227,菌落总数为7.3×109CFU/mL。本研究给该天然生物制剂应用提供了理论依据。

维科天然生物制剂,干酪乳杆菌,促进生长,响应面法

维科天然生物制剂由日本维科株式会社研制,其主要成分为甜叶菊及其残渣、菊花等,经过萃取、分离精制、制得原液。甜叶菊中含有类黄酮、生物碱、水溶性叶绿素、叶黄素以及中性的水溶性低聚糖、自由糖、氨基酸、脂质等[1-4]。同时,它具有高甜度、低热量、无毒、无副作用等特点[5],已被广泛应用于食品、饮料、医药、日用化工、酿酒、化妆品等行业,实现了甜叶菊渣低成本、无二次污染的综合利用。各类学者对维科天然生物制剂的多种生物活性进行了多方面的研究,发现了其具有抗氧化、抗过敏等多种生物活性,奚印慈发现维科生物制剂具有很强的抗氧化性,并于1998年在日本食品工学会上正式发表了世界第一篇关于维科生物制剂抗氧化的论文[5-6]。于慧等人在奚印慈研究基础上,对维科生物制剂的强抗氧化活性成分进行分离纯化和结构鉴定,确定多酚类物质是维科生物制剂强抗氧化作用的主要物质基础[7]。此外,维科生物制剂还具有预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病等的功效[8-10]。但关于维科天然生物制剂在微生物方面的研究较少,卢占军等人将甜叶菊渣经过适当的预处理,再利用微生物多菌种混合协同固态发酵技术处理,提高其营养价值[11]。而本实验首次探究了维科生物制剂对干酪乳杆菌生长的影响。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是人体肠道内的重要微生物[12],具有高效降血压降胆固醇,并且能够诱导产生抗菌素,促进细胞分裂,产生抗体免疫,增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等作用。干酪乳杆菌还具有缓解乳糖不耐症,缓解过敏等益生保健作用[13]。在干酪乳杆菌优化培养条件实验中影响菌体产量的主要因素有葡萄糖、蛋白胨等[14-15],而维科天然生物制剂富含多糖、多酚、微量元素等特种营养物质[8]。

表1　维科生物制剂基本成分[8]

本实验将维科天然生物制剂以不同的浓度加入培养干酪乳杆菌的培养基中,结合不同的培养条件,采用响应面实验设计,找出最优条件,旨在为开发一种新的促进干酪乳杆菌生长的培养方法提供依据,使得维科天然生物制剂这种利用废弃植物综合利用生产的天然生物制剂得到更广泛的实际应用。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

干酪乳杆菌GL实验室保存;维科生物制剂由日本维科株式会社研发并提供,将甜叶菊及其残渣、菊花等通过萃取、分离精制后制得原液[16](质量浓度为0.21 g/mL);MRS培养基、MRS肉汤杭州微生物试剂有限公司。

THZ-300型恒温培养摇床、隔水式恒温培养箱、LRH-250CL低温生化培养箱上海一恒科技有限公司;DSX-280B型不锈钢自动手提式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;便携式pH计梅特勒-托利多仪器上海有限公司;BCM型生物洁净工作台苏净集团安泰公司;T6新世纪紫外与分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;DGG-9203AD型电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司;WP800TL23-K3微波炉格兰仕微波炉电器有限公司。

1.2培养条件优化

1.2.1菌种活化从冰箱中取出分离保存的干酪乳杆菌甘油管菌种,在室温静置5 min后以1.0%的接种量接到装有5 mL液体培养基的试管中(2个平行),摇匀后37℃静止培养12 h;之后进行划平板(2个平行),37℃静止培养24 h后,挑取单菌落于5 mL液体培养基中(2个平行),摇匀后37℃静止培养12 h后用于实验。

1.2.2静置培养和摇床培养的影响将活化的菌液按1.0%接种量接入装有5 mL液体培养基的试管中,每组准备3个平行,摇匀后37℃静置培养和60 r/min振荡培养48 h,每隔12 h取一次样(先摇匀后取样),测定培养菌液的OD610 nm值。

1.2.3培养基起始pH的确定将液体培养基的起始pH以10 mol/L HCl、40% NaOH溶液分别调节为4、5、6、7和8,以1.0%的活化菌液加入到不同起始pH的液体培养基中(3个平行),摇匀后37℃恒温培养12 h,测定培养菌液的OD610 nm值。

1.2.4培养温度的确定将活化的菌液按1.0%接种量接入液体培养基中(3个平行),摇匀后分别在30、35、40、45℃条件下培养12 h,测定培养菌液OD610 nm值。

1.2.5接种量的确定将活化的菌液分别按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的接种量接到液体培养基中,摇匀后37℃恒温培养12 h,测定培养液OD610 nm值。

1.2.6干酪乳杆菌标准曲线的制定每隔2 h取样测定培养液OD610 nm值和活菌数,活菌数采用平板菌落记数法(GB/T4789.2-1994),绘制生长曲线。

1.2.7维科天然生物制剂对干酪乳杆菌生长的影响为研究维科天然生物制剂随浓度变化对干酪乳杆菌生长的影响,来优化其培养条件,用二倍稀释法配制不同浓度的维科生物制剂。取维科天然生物制剂原液(质量浓度为0.21 g/mL)400、200、100、50、25、12.5 μL分别加入到含有5 mL的MRS液体培养基中,获得维科天然生物制剂浓度分别为16.8、8.4、4.2、2.1、1.1、0.55 mg/mL的MRS液体培养基。

将活化后的菌液按照1.0%的添加量添加于含有维科天然生物制剂浓度分别为16.8、8.4、4.2、2.1、1.1、0.55 mg/mL的MRS液体培养基中,以不添加维科天然生物制剂的培养基作空白对照。

培养时间为48 h,0～12 h内每隔6 h测定培养液OD610 nm值,之后每隔12 h测定培养液OD610 nm值,并在12 h时测定培养液活菌数。

1.3响应面实验因素和水平的选择

根据单因素实验所得的结果,选取其中较佳条件,利用Design Expert 8.0.5软件进行工艺参数的优化组合,采用Box-Behnken的设计原理,进行四因素三水平响应面设计优化工艺参数,即选取温度、pH、接种量、WIC浓度4个因素作为自变量,以干酪乳杆菌的OD610 nm值作为响应值进行实验的优化,实验因素和水平见表2。

表2　实验因素水平及编码

2　结果与讨论

2.1静置培养和摇床培养的影响

由图1可知,开始时静置和摇床培养的OD610 nm值一样,随着培养时间的延长,OD610 nm值逐渐增大。在静置培养和摇床培养的0～12 h时间内菌种迅速生长繁殖,12～24 h时间内生长稳定;在整个培养阶段,静置培养明显优于振荡培养,但摇床培养的菌种也处于生长繁殖状态,它的OD610 nm值也不断地增高,结果表明,干酪乳杆菌适合于静置培养,最适培养时间为12 h。

图1　静置培养和摇床培养OD610 nm值Fig.1　OD610 nm value of static culture and shaking culture

2.2培养基起始pH的确定

由图2可知,pH为4～8条件下干酪乳杆菌都能稳定生长,故其对酸碱环境的适应能力较好。研究者在模拟人体消化道环境中,对2株干酪乳杆菌耐酸生物学特性研究。结果表明,两株干酪乳杆菌在pH为2.5～4.5的人工胃液或pH为7.6～8.1的人工肠液中作用3 h后均能生长,活菌数约达到1010CFU/mL[17]。实验结果表明,培养基起始pH对菌种生长OD610 nm值有一定的影响,其中在pH为4时生长较为缓慢。

图2　起始pH对干酪乳杆菌生长的影响Fig.2　Effect of initial pH on the growth of Lactobacillus casei

2.3培养温度的确定

干酪乳杆菌在不同温度条件下培养12 h,OD610 nm值结果见图3。由图3可知,培养温度在30℃时OD610 nm值为1.187,到35℃时提高到1.999,而超过35℃后,随着温度的提高OD610 nm值有下降趋势,但下降不是很明显,说明干酪乳杆菌最适培养温度为35℃,而且在低温条件下干酪乳杆菌生长缓慢,在高温时也可以生长。研究者以具有较高ACE抑制活性的干酪乳杆菌LC-15发酵制备酸乳,通过感官评分,确定了干酪乳杆菌LC-15发酵酸乳的最佳发酵温度为37℃[18]。李市场等寻求干酪乳杆菌6028发酵产酸的最佳条件,结果发现,34℃时产酸能力最强[19]。

2.4接种量的确定

由图4可知,随着接种量的增多,OD610 nm值也逐渐变大。当接种量为0.5%时OD610 nm值为1.552,接种量为1.0%时OD610 nm值提高到2.016,有明显增长趋势;而接种量为1.0%、1.5%、2.0%时OD610 nm值差异不明显。

图4　接种量对干酪乳杆菌生长的影响Fig.4　Effect of inoculation amount on growth of Lactobacillus casei

2.5干酪乳杆菌生长标准曲线

在培养条件为温度35℃,时间12 h,pH为6,接种量为1.0%下,绘制该干酪乳杆菌生长曲线如图5,OD610 nm值可达到2.016,活菌数达到4.35×109CFU/mL。

图5　干酪乳杆菌不同培养时间段OD610 nm值和菌落对数值Fig.5　OD610 nm value and colonies number value of Lactobacillus casei at different time periods of cultivation

2.6WIC浓度对菌落总数的影响

在干酪乳杆菌的最佳条件温度为35℃,时间为12 h,pH为6,接种量为1.0%时,将活化菌液培养在添加了不同浓度的维科天然生物制剂的液体培养基中培养。由图6,图7可以看出维科天然生物制剂对干酪乳杆菌具有良好的促进作用,随着WIC浓度的增加干酪乳杆菌的OD610 nm值和菌落对数值处于明显的增加趋势,明显大于空白组,且在WIC浓度为 16.8 mg/mL时菌落对数值增长最为显著,OD610 nm值达到2.218,活菌数达到6.4×109CFU/mL。结果显示了维科天然生物制剂可以促进干酪乳杆菌的生长。

图6　维科天然生物制剂对干酪乳杆菌OD610 nm的影响Fig.6　Effect of WIC natural biologics on OD610 nm value of Lactobacillus casei

图7　维科天然生物制剂对干酪乳杆菌菌落对数值的影响Fig.7　Effect of WIC natural biologics on colonies number of Lactobacillus casei

2.7响应面分析设计及结果

根据Design Expert 8.0.5软件对实验进行安排,实验结果分析见表3～表4。

表3　响应面实验设计及结果

表4　回归模型方差分析

注:不显著(p>0.05),显著(p≤0.05),极显著(p≤0.01)。

对响应值及各因素进行拟合,得到关于OD610 nm的回归方程如下:

OD610 nm=-30.70212+0.87494X1+4.60067X2+2.23733X3+0.015030X4-8.73333E-003X1X2-0.015667X1X3+6.98413E-004X1X4-0.088000X2X3-5.05952E-004X2X4+5.53571E-003X3X4-0.010299X12-0.33608X22-0.40383X32-1.81701E-003X42

从表4可知,温度(X1)对干酪乳杆菌的OD610 nm值影响最大,其次是接种量(X3),pH(X2),WIC浓度(X4);模型p<0.0001,达到极显著水平,回归方程失拟检验p>0.05,差异不显著,说明所得的回归方程拟合比较好。

图8　各因素交互作用对OD610 nm值的影响Fig.8　Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on OD610 nm value

响应面坡度相对平缓表示两因素交互作用不显著,坡度相对较陡表示两因素交互作用显著。由图8可以看出,各因素交互作用对OD610 nm值的影响显著,该结果与方差分析结果一致。

2.8最佳工艺参数确定及验证性实验

通过对模型方程解逆矩阵得出促进干酪乳杆菌生长的最优条件为:温度为39.51℃,培养基起始pH为6.16,接种量为1.34%,WIC剂浓度为12.56 mg/mL,在此条件下干酪乳杆菌的OD610 nm值达到2.252,为了验证模型的可靠性,在最优条件下对干酪乳杆菌的OD610 nm值进行验证性实验,平行实验3次,干酪乳杆菌的OD610 nm平均值为2.227,与理论预测值(2.252)接近,菌落数高达7.3×109CFU/mL,证明该回归模型具有可靠性。因此,采用此模型优化得到的提取参数准确可靠,具有实用价值。

3　结论

在单因素实验的基础上,采用响应面分析法优化了各参数,结合验证实验确定了促进干酪乳杆菌生长的最优条件:温度为39.51℃,培养基起始pH为6.16,接种量为1.34%,维科天然生物制剂浓度为12.56 mg/mL,干酪乳杆菌的OD610 nm值达到2.227,菌落数高达7.3×109CFU/mL。响应面分析可见温度对干酪乳杆菌的OD610 nm值影响最大,其次是接种量,pH,WIC浓度。干酪乳杆菌由于其对宿主营养、免疫、防病等显著的益生功效,成为研究、开发、生产的焦点,本实验将植物废弃资源用到菌种的生长条件中,为开发新的促进益生干酪乳杆菌生长的培养方法及实际应用提供了充分的理论依据,也为充分有效地利用天然植物资源、保护地球环境做出了点滴贡献。

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Effect of WIC natural biologics on the growth of Lactobacillus casei

LI Dan,REN Xiao-jing,CHEN Ting,XI Yin-ci*

(College of Food Science and Techonlogy,Shang hai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In order to promote the growth of Lactobacillus casei,a new cultivation method was developed by using plant resources.Making use of response surface methodology based on single factor optimization experiment,it is the first time to optimize the effect of WIC natural biologics primarily,which could alleviate the environmental pollution.The results proved that,WIC natural biologics could positively promote growth of Lactobacillus casei.With the applying of response surface analysis techniques,the optimal promotional growth conditions could be achieved as:the temperature of medium was 39.51℃,the initial pH of medium was 6.16,the inoculation quantity was 1.34%,the optimum concentration of WIC biologics preparation training was 12.56 mg/mL,the actual OD610 nmvalue of Lactobacillus was 2.227,and colonies total number reached 7.3×109CFU/mL at last.This thesis would provide a theoretical basis for the application of natural biologics.

WIC natural biologics;Lactobacillus casei;Promoting growth;Response surface methodology

2015-09-21

李丹(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：天然物质生物活性，E-mail：waterker@163.com。

奚印慈(1957-)，女，博士，研究方向：天然物质的生物活性成分，E-mail：xiyinci@gmail.com。

上海海洋大学-日本维科株式会社合作研究基金项目(D8006-120034)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0148-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.021