广东地区汉族人群VEGF基因5′端SNP位点遗传多态性

何文智，马晓燕，冼嘉嘉，袁天丽，李少英，李双琳，刘海波，黎　青（广州医科大学附属第三医院法医物证司法鉴定所 广东省产科重大疾病重点实验室，广东 广州 510150）

广东地区汉族人群VEGF基因5′端SNP位点遗传多态性

何文智，马晓燕，冼嘉嘉，袁天丽，李少英，李双琳，刘海波，黎青
（广州医科大学附属第三医院法医物证司法鉴定所 广东省产科重大疾病重点实验室，广东 广州 510150）

目的 调查广东地区汉族人群VEGF基因5′端SNP位点的遗传多态性，为法医学应用及群体遗传学研究提供基础数据。方法 DNA微测序技术SNaPshot分析184例广东地区无关个体VEGF基因5′端4个SNP位点（rs699947、rs1570360、rs833061、rs2010963）的遗传多态性。应用PowerMarker v3.25软件进行统计分析。结果 184例广东地区汉族无关个体VEGF基因5′端4个SNP位点基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），每个位点均检出3种基因型。rs833061和rs699947位点紧密连锁。共检出6种单倍型，其中C-G-T-C、C-G-T-G、A-A-C-G、A-G-C-G频率均＞10%，为主要单倍型。rs699947、rs833061、rs2010963位点的个人识别率为0.583～0.634，非父排除率为0.133～0.144；4个SNP构成单倍型的个人识别率为0.868，非父排除率为0.438。结论 广东地区汉族人群VEGF基因5′端序列呈现出高度遗传多态性，可作为个人识别和亲权鉴定的遗传学指标，同时可用于相关疾病关联分析。

法医遗传学；多态性，单核苷酸；血管内皮生长因子；汉族

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生［1-2］。VEGF属血小板源生长因子超家族，目前主要包括VEGF-A、胎盘生长因子、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E［3］。VEGF基因位于6p21.3，启动子区及5′非翻译区所在的SNP位点在人群中具有较高的多态性，在肿瘤、不明原因习惯性流产等疾病中被广泛研究［4-5］。

本研究应用DNA微测序技术SNaPshot调查广东地区汉族人群 VEGF基因 5′端 rs699947、rs1570360、rs833061、rs2010963 4个SNP位点的分布情况，探讨其法医学意义，也为相关疾病分析提供遗传学参数。

1　材料与方法

1.1DNA提取及PCR扩增

经知情同意后采集184名广东地区汉族无关个体外周血，EDTA抗凝，采用DNeasy®Blood&Tissue试剂盒（德国QIAGEN公司）提取基因组DNA。

PCR扩增及SNaPshot微测序引物采用Oligo 6设计（表1），微测序引物5′端增加长度不等的聚胞苷酸（PolyC），由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

PCR复合扩增体系：模板DNA 100ng，1×LA Taq缓冲液，dNTP 0.1mmol/L，每个片段上下游引物反应浓度均为1μmol/L。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃30s，62℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min。

表1　基因扩增引物及探针序列

1.2基因检测及测序验证

取2μL PCR产物用虾碱性磷酸酶FastAP及核酸外切酶ExoⅠ（立陶宛Fermentas公司）消化15 min。SNaPshot体系：反应混合液1μL，酶切后的PCR产物4 μL，各位点微测序引物终浓度2 μmol/L，ddH2O补体积至10 μL。SNaPshot反应条件：96℃ 10 s；96℃10s，50℃ 5s，60℃ 30s，25个循环；60℃ 30s。反应产物经FastAP消化15 min后用3500型遗传分析仪（美国AB公司）检测。

随机取20例样本，采用反向扩增引物分别对目的片段进行基因测序，以验证基因型。测序试剂盒为BigDye Terminator v3.1（美国AB公司），具体方法参照试剂盒操作手册。测序仪器为3500型遗传分析仪（美国AB公司）。

1.3数据处理

采用直接计数法计算各SNP位点的基因型频率和等位基因频率。用PowerMarker v3.25软件进行Hardy-Weinberg平衡检验、连锁不平衡分析、单倍型分析及单倍型频率计算。按Nei［6］的方法计算杂合度（H），用Modified-Powerstats（标准版）软件计算个人识别率（DP）、非父排除率（PE）及多态信息含量（PIC）等群体遗传学参数。

2　结　果

2.1多态性分析

VEGF基因 5′端 4个 SNP位点［rs699947 （-2578C/A）、rs1570360（-1154G/A）、rs833061（-460T/C）、rs2010963（+405G/C）］均检出2种等位基因构成的3种基因型。图1～3显示S13-2及S13-4两个样本SNaPshot检测及测序验证结果，S13-2的4个SNP位点均为杂合，S13-4均为纯合。4个SNP位点的等位基因频率、基因型频率见表2。经检验，4个SNP位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

表2　广东地区汉族人群VEGF基因4个SNP位点等位基因频率、基因型频率　（n=184）

2.2连锁不平衡分析

连锁不平衡分析结果显示，rs699947与rs833061紧密连锁（D′=0.917，表3）。

表3　广东地区汉族人群VEGF基因4个SNP位点连锁不平衡系数　（n=184）

2.3群体遗传学参数

单倍型分析显示，所检样本rs699947、rs1570360、rs833061及rs2010963 4个SNP位点可构成6种单倍型，相应的单倍型频率和基因型频率见表4～5。根据4个SNP位点在广东地区汉族人群的遗传多态性分布情况，计算各位点的群体遗传学参数，结果见表6。单倍型遗传标记的DP和PE分别为0.868和0.438。

表4　广东地区汉族人群VEGF基因4个SNP位点构成的6种单倍型频率　（n=184）

表5　广东地区汉族人群VEGF基因4个SNP位点构成的基因型频率　（n=184）

表6　广东地区汉族人群VEGF基因4个SNP位点及其单倍型的群体遗传学参数（n=184）

3　讨　论

3.1广东地区汉族人群VEGF基因5′端SNP位点分布情况

SNP具有数量多、分布广泛、多为二等位基因易于自动分型、适于快速高流量检测等特点，目前已成为医学、法医学等领域研究的热点。

本研究采用DNA微测序技术调查VEGF基因启动子区及 5′非翻译区 4个 SNP位点（rs699947、rs1570360、rs833061、rs2010963）在广东地区汉族人群的分布情况。上述4个SNP位点均在基因编码区之外，因此不会改变蛋白质序列。但有报道［7-8］称不同等位基因型可能会参与基因表达的调节。

4个SNP位点均检出2种等位基因构成的3种基因型。连锁分析发现，rs699947与rs833061连锁不平衡系数为0.917，显示出极强的紧密连锁。上述SNP构成6种单倍型，其中C-G-T-C、C-G-T-G、A-A-CG、A-G-C-G频率均＞10%，为主要单倍型。

本研究获得的广东地区汉族人群VEGF基因5′端SNP位点的等位基因频率、基因型频率以及单倍型频率，为疾病相关性研究提供了基础数据。

3.2法医学意义

VEGF基因 5′端 4个 SNP位点中，rs699947、rs833061、rs2010963的 DP为 0.583~0.634，PE为0.133~0.144，具有较高的个人识别能力。4个SNP构成单倍型的DP为0.868、PE为0.438。说明上述4个SNP构成的单倍型遗传标记具有较高的鉴别能力，可用于法医学个人识别和亲子鉴定。

［1］Pang L，Wei Z，Li O，et al.An increase in vascular endothelial growth factor（VEGF）and VEGF soluble receptor-1（sFlt-1）are associated with early recurrent spontaneous abortion［J］.Plos One，2013，8（9）：e75759.

［2］Samli H，Demir BC，Ozgoz A，et al.Vascular endothelial growth factor gene 1154 G/A，2578 C/A，460 C/T，936 C/T polymorphisms and association with recurrent pregnancy losses［J］.Genet Mol Res，2012，11（4）：4739-4745.

［3］Lash GE，Innes BA，Drury JA，et al.Localization of angiogenic growth factors and their receptors in the human endometrium throughout the menstrual cycleand in recurrent miscarriage［J］.Hum Reprod，2012，27（1）：183-195.

［4］李珠玉，游泽山，苏秀梅，等.复发性流产与夫妻双方绒毛血管内皮生长因子基因多态性的关系［J］.中山大学学报（医学科学版），2011，32（1）：85-89.

［5］Bayhan Z，Simsek T，Ergul E，et al.Serum cytokine levels in patients with colorectal cancers according to tumor stages and VEGF gene polymorphism［J］.Hepatogastroenterology，2014，61（135）：1889-1894.

［6］Nei M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals［J］. Genetics，1978，89（3）：583-590.

［7］Prakash S，Agrawal S，Kumar S，et al.Impact of vascularendothelialgrowthfactorsinglenucleotide polymorphism association on acute renal allograft rejection［J］.Nephron，2015，129（2）：91-96.

［8］Peng ML，Tsai YY，Tung JN，et al.Vascular endothelial growth factor gene polymorphism and protein expression in the pathogenesis of pterygium［J］.Br J Ophthalmol，2014，98（4）：556-561.

（本文编辑：李成涛）

Genetic Polymorphisms of SNP Located in the 5′Region of VEGF Gene in Han Population in Guangdong

HE Wen-zhi，MA Xiao-yan，XIAN Jia-jia，YUAN Tian-li，LI Shao-ying，LI Shuang-lin，LIU Hai-bo，LI Qing
（Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province，Forensic Identification Institute of the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China）

Objective To investigate the genetic polymorphism of SNP located in the 5′region of the vascular endothelial growth factor（VEGF）gene in Han population in Guangdong and provide basic data for forensic application and population genetics research.Methods The genetic polymorphisms of 4 SNP loci（rs699947，rs1570360，rs833061，rs2010963）within 5′region of VEGF gene of 184 unrelated individuals in Han population in Guangdong were analyzed by DNA micro sequencing technology SNaPshot. The statistical analysis was carried out by PowerMarker v3.25 software.Results The genotype distributions of the 4 SNP loci within 5′region of VEGF gene of 184 unrelated individuals in Han population in Guangdong were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium （P＞0.05）and 3 kinds of genotypes were detected from each loci.There was high linkage disequilibrium between the rs833061 and rs699947 SNP loci.Six haplotypes were observed，while the frequency of C-G-T-C，C-G-T-G，A-A-C-G and A-G-C-G were more than 10%，which were the main haplotypes.The discrimination probabilities（DP）of rs699947，rs833061，and rs2010963 loci were between 0.583 and 0.634，with the power of exclusion （PE）between 0.133 and 0.144.The DP and PE of haplotypes of 4 SNP were 0.868 and 0.438，respectively.Conclusion There are great polymorphisms in the 5′region of VEGF gene in Han population in Guangdong，which could be used as genetic indexes for individual identification and paternity testing，as well as association analysis of the related diseases.

forensic genetics；polymorphism，single nucleotide；vascular endothelial growth factor；Han nationality

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.005

1004-5619（2016）04-0257-04

上海市法医学重点实验室开放课题资助项目（KF1305）；广东省省级科技计划项目（2013B022000023）

何文智（1977—），男，壮族，硕士，主要从事法医物证鉴定及DNA多态性研究：E-mail：hewz2000@163.com

黎青，女，博士，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事法医物证学鉴定和研究；E-mail：81292522@163.com

2015-03-13）