MALDI-TOF-IMS分析DAI大鼠脑组织内差异蛋白的分布

任冠恒，翁榕花，施　妍，黄　平，邓恺飞，刘宁国，陈忆九（.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 20006；2.南方医科大学基础医学院法医学系，广东 广州 5055；.莆田市公安局城厢分局，福建 莆田 500）

·论著·

MALDI-TOF-IMS分析DAI大鼠脑组织内差异蛋白的分布

任冠恒1，2，翁榕花3，施妍1，黄平1，邓恺飞1，刘宁国1，陈忆九1
（1.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；
2.南方医科大学基础医学院法医学系，广东 广州 510515；3.莆田市公安局城厢分局，福建 莆田 351100）

目的 基于基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱成像（matrix assisted laser desorption/ionizationtime of flight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技术建立弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）大鼠脑组织内蛋白差异化表达的质谱成像方法。方法 应用AutoflexⅢ MALDI-TOF质谱仪在质荷比1000～20000范围内对DAI组和对照组脑组织进行质谱扫描，利用ClinProTool 2.2软件对两组数据进行统计学分析，挑选出存在表达差异的蛋白质分子进行质谱成像，观察不同质荷比的蛋白质分子在脑组织中的分布情况。结果 质荷比为4963、5634、6253、6714及7532的5个蛋白质分子在DAI大鼠脑组织内表达量存在差异。结论 MALDI-TOF-IMS可用于大鼠DAI后脑组织内差异蛋白的研究，初步建立了质谱成像技术检测DAI大鼠脑组织中差异蛋白分布的分析方法。

法医病理学；弥漫性轴索损伤；质谱分析法；基质辅助激光解吸电离；脑干；大鼠

弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）是一种以脑白质轴索弥漫性损伤为主的外伤性脑损伤，常伴有明显的神经病学和行为学的改变［1］。临床上其死亡率和发病率均较高，在法医学实际检案中DAI也并不少见，有学者［2］认为约30%因颅脑损伤死亡的案例与DAI有关。然而，DAI病理学机制的阐明仍是法医病理学者面临的一大难题。近年来，分子标志物对研究病理学机制起到越来越重要的作用，而差异蛋白质组学的研究方法已广泛应用于分子标志物的寻找、鉴定等方面［3］。迄今为止，已有多种用于分析样品中蛋白质的技术方法，如双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究中应用最广泛的蛋白质分析方法，但该技术的缺点是样品制备过程破坏了组织形态学结构与特征蛋白质的直接关系，与细胞组成和空间分布相关的蛋白质信息几乎全部丢失［4］，在样本收集过程中存在细胞异质性的问题。

基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱成像（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技术是近年来发展最快的蛋白质组学新技术之一，已成功用于直接分析生物组织切片，该方法不仅避免了繁琐的样品提取、纯化和分离步骤，而且能够获取生物组织中蛋白质和多肽表达谱，并绘制二维质谱图像［5］，已广泛应用于临床诊断、药物研发等领域［6］。本研究利用MALDI-TOF-IMS技术对DAI大鼠脑组织进行质谱扫描，获取脑组织切片上每个点的质荷比（m/z）信息，绘制二维质谱图像，得到不同质荷比蛋白质分布情况的完整质谱图，为研究DAI蛋白质分子的空间分布奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1主要仪器与试剂

AutoflexⅢ MALDI-TOF IMS、Leica CM 1950冷冻切片机、ImagePrep自动基质喷雾装置、MALDI专用导电玻片、基质芥子酸（sinapic acid，SA）、蛋白标准品Ⅰ均购自德国Bruker公司，OCT冰冻切片包埋剂（美国Sakura公司），色谱纯乙腈（美国Fluka公司），三氟乙酸（美国Sigma公司）。其他试剂均为国产分析纯，水为超纯水（德国Millipore公司）。

1.2实验动物与分组

正常雄性SD大鼠15只，体质量200～220g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，随机分成DAI组（n=10）和对照组（n=5）。

1.3动物模型制作

参照Marmarou方法［7］制备大鼠DAI损伤模型，对照组同样暴露，但不进行打击致伤。

1.4样品制备

大鼠致伤24 h后，用 1%苯巴比妥钠溶液以50 mg/kg腹腔注射麻醉，断头取脑，脑组织用铝箔松软包裹后立即转移至-80℃冰箱中冷冻保存。

利用冰冻切片机将大鼠的大脑、小脑、脑干沿矢状面分别进行连续切片，厚度为10μm，并进行HE染色和嗜银染色。

另取冰冻切片组织放置在导电玻片上，然后将载有切片的载玻片转入真空干燥器干燥40min，再依次放入70%、90%、100%的乙醇溶液中，各浸洗30 s，再次真空干燥。用含0.2%三氟乙酸的60%乙腈水溶液配制成10mg/mL的SA基质溶液。使用ImagePrep自动基质喷雾装置将基质溶液均匀覆盖在切片上。

1.5数据分析

1.5.1质谱扫描成像

使用FlexControl 3.0质谱操控软件（德国Bruker公司）设置质谱扫描条件，激光束直径200 μm，正离子模式和线性模式，质量扫描范围m/z 1000～20000；对DAI组和对照组大鼠脑组织切片进行质谱扫描，并使用FlexImaging 3.0软件（德国Bruker公司）对质谱扫描数据进行分析和成像。

1.5.2数据采集与统计学分析

利用ClinProTool 2.2软件对两组数据进行统计学分析，找出DAI组和对照组大鼠脑组织切片之间存在表达量差异的蛋白质条带，采用FlexImaging 3.0软件对其进行质谱成像。

2　结　果

2.1染色结果

HE染色：DAI组脑组织软脑膜下大脑皮质呈片状出血，轴索肿胀，组织结构疏松（图1A）；对照组未见异常。

嗜银染色：DAI组可见脑神经轴索断裂、增粗、扭曲变形及收缩球形成，排列稀疏（图1B）；对照组未见异常。

2.2蛋白质组学差异分析及质谱成像结果

将DAI组和对照组样品数据导入ClinProTool 2.2软件经统计分析后，挑选出其中5个存在表达量差异的蛋白质分子（P＜0.05），质荷比分别为4 963、5 634、6253、6714及7532。与对照组相比，DAI组中质荷比为4963的蛋白质分子在小脑中表达下调，在大脑皮质、髓质及脑干中表达上调；质荷比为5 634的蛋白质分子在大脑皮质及髓质中表达量下调，在小脑和脑干中表达量上调；质荷比为6253的蛋白质分子在大脑皮质、髓质及小脑中表达下调，在脑干中表达上调；质荷比为6714的蛋白质分子在大脑皮质、髓质及小脑中表达下调，在脑干中表达上调；质荷比为7532的蛋白质分子在大脑髓质中表达下调，在大脑皮质、小脑及脑干中表达上调（表1）。质谱成像图中的彩色斑点代表蛋白质的定位，每个斑点颜色的深浅与激光在每一个点或像素上检测到的信号大小相关，即颜色越深，则蛋白质的表达越丰富。从质谱成像图中可以看出，不同质荷比的蛋白质分子在两组大鼠脑组织的表达量不同，在脑组织中的分布存在明显差异（图2）。

表1　5个差异蛋白峰

3　讨　论

DAI是重要的脑外伤类型之一，自从1956年Strich首次报道DAI损伤的病理学改变后，很多学者对DAI的发生机制及病理形态学改变进行了大量研究［8］。目前认为DAI的发生机制是由于外力作用于头部对脑组织引起的剪切、牵张及旋转作用，使神经纤维扭曲或牵拉过度导致神经纤维断裂，形成原发性轴索损伤所致［9］。随着差异蛋白质组学的发展，对DAI病理学改变的观察主要为对蛋白质的检测。迄今为止，已有多种用于分析组织样本中蛋白质的技术方法，最常用的方法是利用二维凝胶电泳技术分离蛋白质和利用质谱和数据库搜索的方法鉴定蛋白质［10-11］。

Boone等［12］报道利用激光捕获切割显微（laser capture microdissection，LCM）技术从混合种群的脑细胞中获取特定的同类细胞乃至单个细胞，利用实时PCR技术和微阵列分析技术对mRNA进行分析，研究外伤性脑损伤海马中基因表达的情况。该方法不仅解决了细胞异质性的问题，而且在一定程度上可研究脑损伤后海马中基因表达的分布情况。这为外伤性脑损伤的基础研究起到重要作用，但这种方法操作较为繁琐，是一项费时费力的工作。

本实验采用MALDI-TOF-IMS对DAI大鼠脑组织内差异蛋白进行质谱成像，观察不同蛋白质分子在脑组织中的分布情况，初步建立了基于MALDI质谱成像的DAI大鼠脑组织内差异蛋白的质谱成像方法。实验采用ClinProTool 2.2软件对DAI组和对照组的样品数据进行统计学分析，挑选出5个差异蛋白，并利用这5个差异蛋白进行质谱成像。从质谱成像图中可以看出，不同质荷比的蛋白质分子在脑组织中分布不同，相同质荷比的蛋白质分子在对照组和DAI组中的分布也不同，本研究结果清晰显示了成像图中蛋白质分子在脑组织中的分布情况。与对照组相比，质荷比为4 963的蛋白质分子在DAI组胼胝体部位分布较为密集，提示胼胝体部位该蛋白表达量上升；质荷比为5 634的蛋白质分子在DAI组大脑中分布较少，脑干中分布较多，而在对照组大脑中分布较多，脑干中分布较少；质荷比为6253的蛋白质分子在DAI组脑干中分布较对照组多；质荷比为6714的蛋白质分子在大脑髓质及小脑分布较多，大脑皮质中的分布较少，在DAI组脑干中分布较明显，但在对照组脑干中几乎没有分布；质荷比为7532的蛋白质分子主要分布于大脑皮质，在DAI组的小脑及脑干有分布，但在对照组的小脑及脑干则几乎没有分布。

DAI好发于灰、白质交界区，其中胼胝体、脑干等部位为其特征性部位［13］。根据质谱成像图的观察分析，发现与对照组相比，5个蛋白质分子在DAI组脑干中分布均明显增多，而质荷比为4963的蛋白质分子在DAI组胼胝体分布也相对密集，5个蛋白在DAI组脑干和胼胝体中分布增多提示该易损部位发生了蛋白质表达上调的情况，很可能成为DAI的潜在标志物。

本结果显示，应用MALDI-TOF-IMS研究DAI大鼠脑组织内差异蛋白的分布是可行的，为进一步筛选、鉴定和定位DAI蛋白标志物提供了重要线索。后续研究将进一步扩大样品量，特别是系统分析这些蛋白标志物在不同损伤时间的变化特征和规律，对法医病理学研究具有重要意义。

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（本文编辑：邹冬华）

Analysis of Differentially Expressed Proteins Distribution in the Rat Brains with DAI by MALDI-TOF-IMS

REN Guan-heng1，2，WENG Rong-hua3，SHI Yan1，HUANG Ping1，DENG Kai-fei1，LIU Ning-guo1，CHEN Yi-jiu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Shanghai Forensic Service Platform，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，P.R.China，Shanghai 200063，China；2.Department of Forensic Science，School of Basic Medicine Science，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；3.Chengxiang Branch of Putian Public Security Bureau，Putian 351100，China）

Objective To establish the imaging mass spectrometry for analysis of differentially expressed proteins distribution in the rat brains with diffuse axonal injury（DAI）based on matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight imaging mass spectrometry（MALDI-TOF-IMS）.Methods MALDITOF-IMS scanning were conducted on the brains of DAI group and control group in the m/z range of 1000 to 20000 using AutoflexⅢ MALDI-TOF spectrometer.ClinProTool 2.2 software was used for statistical analysis on the data of two groups，and then the differentially expressed proteins were picked out to conduct imaging.The distribution of the proteins with different m/z in the rat brains was observed. Results Five proteins with different m/z，including 4 963，5 634，6 253，6 714 and 7 532，differentially expressed in the rat brains with DAI.Conclusion MALDI-TOF-IMS can be used for studying the differentially expressed proteins in rat brains with DAI and the analysis method is established for exploring the distribution of differentially expressed proteins in the rat brains with DAI using imaging mass spectrometry. Key words：forensic pathology；diffuse axonal injury；mass spectrometry；matrix-assisted laser desorptionionization；brain stem；rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.001

1004-5619（2016）04-0241-04

国家自然科学基金资助项目（81273338、81273339、81571851）；中央级科研院所科研专项（GY2015G-2、GY2013Z-3）；上海市科委社会发展专项（14231202500）；上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目（16DZ2290900）

任冠恒（1990—），女，硕士研究生，主要从事法医病

理学研究；E-mail：rgh_0101@163.com

刘宁国，男，研究员，主任法医师，主要从事法医病理学研究；E-mail：liuningguo@foxmail.com

陈忆九，男，研究员，博士研究生导师，主要从事法

医病理学研究；E-mail：chenyj@ssfid.cn

2015-12-23）