人体脑组织RNA表达水平与早期PMI的相关性

吕叶辉，马开军，李志宏，顾　峻，鲍建瑛，杨智昉，高　静，曾　颜，陶　丽，陈　龙（．上海健康医学院，上海 08；．上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室，上海 0008；．复旦大学基础医学院法医学系，上海 000）

人体脑组织RNA表达水平与早期PMI的相关性

吕叶辉1，马开军2，李志宏1，顾峻1，鲍建瑛1，杨智昉1，高静1，曾颜3，陶丽3，陈龙3
（1．上海健康医学院，上海 201318；2．上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室，上海 200083；3．复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032）

目的 探讨人体脑组织多种RNA指标的表达水平与早期死亡时间（PMI）的相关性。方法 选取12例已知PMI（4.3～22.5h）的个体，提取脑组织总RNA。选取8种常用RNA指标（β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9、miRNA-125b），通过实时荧光定量PCR技术检测其在脑组织中的表达水平。运用geNorm软件筛选早期PMI表达稳定的内参指标，并分析其表达水平与相关因素（年龄、性别、死亡原因）的关系。运用R软件将内参标准化的RNA指标代入前期研究建立的数学模型推断PMI，计算推断PMI的误差率以验证模型精确性。结果 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b表达稳定，其表达水平与年龄、性别、死亡原因无关。利用β-actin推断PMI的误差率为24.6%，GAPDH为41.0%。结论 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b在死亡早期表达稳定，适合作为人体脑组织的内参指标。β-actin表达水平与PMI相关性良好，有望成为推测早期PMI的辅助指标。

法医病理学；RNA；脑；死亡时间；实时荧光定量PCR

随着分子生物学技术的发展，运用RNA时序性降解规律推断PMI逐渐成为研究热点。国内外学者在研究中发现RNA并非想象中那样脆弱，可以通过测定某些管家基因mRNA含量变化推断PMI，如β-肌动蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）等［1］，但针对早期PMI的研究相对较少。作为快速高效的RNA定量技术，实时荧光定量PCR技术在PMI推断的研究领域得到越来越多的应用。但由于该方法得到的结果必须依赖于内参指标的标准化处理，寻找稳定、适用的内参指标十分必要。

由于人体死亡后不同个体间存在诸如温度、湿度、死亡原因等内外因素的干扰，无法进行系统规律的研究，通过动物模型对研究人体死亡后体内RNA降解变化规律有着重要的参考价值。笔者在前期研究［2］中已经建立了大鼠脑组织多温度、多RNA指标的数学模型推断早期PMI，但还需要人体样本进一步验证。

本研究收集已知PMI的人体样本，通过实时荧光定量PCR技术对死亡早期人体脑组织各RNA指标转录水平进行检测，筛选表达稳定的内参指标，并将内参标准化的RNA指标代入数学模型进行验证，以期探讨运用该方法推断PMI的准确性和有效性。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：9700型PCR扩增仪、Prism®7500型荧光定量PCR仪（美国AB公司），NanoDrop 1000分光光度计（美国Thermo公司），Agilent 2100生物分析仪（美国Agilent公司）。

试剂：TRIzol试剂盒（美国 Invitrogen公司），RNAlater保护液、PrimeScriptTMRT reagent试剂盒、One Step PrimeScript®miRNA cDNA Synthesis试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司），DEPC水（焦碳酸二乙酯处理并经高温高压灭菌的MiliQ纯水）。

1.2样本

选取12例上海市公安局物证鉴定中心的检案案例，每例均有准确的卷宗记录，包括性别、年龄、环境平均温度、死亡原因、PMI等，详见表1。死者尸体没有呈现肉眼可见的腐败现象，尸体解剖前没有经过冰冻和解冻过程。解剖时取额叶脑组织50～100mg，用无菌眼科剪剪碎后分装于RNAlater保护液中，立即置于-80℃冻存备用。

表1　12例人体样本详细信息

1.3指标选择

本研究选择 8种 RNA指标，分别为 β-actin、GAPDH、核糖体蛋白 S29（ribosomal protein S29，RPS29）、18S核糖体RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）、5S核糖体RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）、U6微核RNA（U6 small nuclear RNA，U6 snRNA）、微小RNA-9（microRNA-9，miR-9）及微小RNA-125b （microRNA-125b，miR-125b）。引物设计至少跨一个外显子或外显子区域以保证cDNA正确的合成与扩增，扩增产物片段长度均在200bp以下。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表2。

表2　实验选取的RNA指标及引物序列

1.4总RNA提取与反转录

准确称取脑组织质量，按照TRIzol试剂盒总RNA提取说明书提取总RNA，加入30μL DEPC水溶解后置于-80℃冻存。NanoDrop 1000分光光度计测定RNA的纯度及浓度。Agilent 2100生物分析仪测定RNA完整性。应用PrimeScriptTMRT reagent试剂盒对总RNA进行反转录，以用于β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA的实时荧光定量PCR。应用One Step Prime-Script®miRNA cDNA Synthesis试剂盒对总RNA进行反转录，以用于5S rRNA、U6 snRNA、miR-9、miR-125b的实时荧光定量PCR。

1.5实时荧光定量PCR

应用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。按照试剂盒说明书配制20 μL反应体系，并应用Prism®7500型荧光定量PCR仪进行扩增。扩增条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。每个样本重复3次，结果由系统自动生成，从而得到各个RNA指标的循环阈值（cycle threshold，Ct值）。

1.6统计学分析

1.6.1内参选择及稳定性评估

运用geNorm v3.5软件（比利时Biogazelle公司）对RNA指标的Ct值进行统计学处理［3］。根据平均表达稳定度M值确定最稳定的指标，M值越小，指标的稳定性越高。根据标准化因子的配对变异V值判断引入新的内参指标是否会对标准化因子产生显著影响，默认V值为0.15，如果Vn/Vn+1（n＞1）小于0.15（当多个V值符合时选取最小值），说明n或n+1个RNA指标可以作为内参指标使用。

运用SPSS v22.0软件分析内参指标表达水平与性别、年龄、死亡原因之间的关系，检验方法分别采用t检验、Pearson相关分析和Kruskal-Wallis检验。检验水准α=0.05。

除内参指标外，其余RNA指标作为候选指标。

1.6.2PMI推断及数学模型验证

运用SPSS v22.0软件对候选RNA指标Ct值进行内参标准化（ΔCt=Ct候选指标-Ct内参均值），内参均值为内参指标的几何平均数，并对各候选指标ΔCt值及PMI进行三次方回归分析并计算相关系数r。检验水准α=0.01。

本课题组在前期研究［2］中已经建立了大鼠脑组织死后24 h内的三元（ΔCt值、温度、PMI）二次数学模型推断PMI。本研究运用R v3.2.3软件（美国RStudio公司）将人体样本数据代入已建模型推断PMI，并计算PMI推断和PMI实际之间的差异程度，用误差率表示，误差率=|PMI推断-PMI实际|/PMI实际×100%。

2　结　果

2.1内参选择及稳定性评估

所有人体样本抽提的RNA均成功扩增，引物特异性高。经geNorm v3.5软件处理后，得到各RNA指标的平均表达稳定度 M值：β-actin＞GAPDH＞18S rRNA＞RPS29＞U6 snRNA＞5S rRNA＞miR-9=miR-125b；标准化因子的配对变异Vn/Vn+1值：V2/V3=0.082，V3/V4=0.095，V4/V5=0.087，V5/V6=0.112，V6/V7=0.137，V7/V8=0.153。结果表明，miR-9和miR-125b最为稳定，而β-actin最不稳定；V2/V3小于0.15且最小，即选择2个或3个RNA指标作为内参最为合适。为和前期研究结果保持一致，本研究选取3个RNA指标作为内参指标，即5S rRNA、miR-9和miR-125b。

分别采用t检验、Pearson相关分析和Kruskal-Wallis检验，分析5S rRNA、miR-9和miR-125b平均表达水平与性别、年龄及死亡原因之间的关系。结果表明，在死亡早期人脑组织中，三种指标的表达水平是稳定的，不受性别影响，男女表达差异无统计学意义（P＞0.05）；上述指标表达水平与年龄之间无相关性（r=0.2102，P＞0.05），排除了年龄因素的影响；上述指标在不同死亡原因中表达水平差异也无统计学意义（P＞0.05）。综合分析，在死亡早期，5S rRNA、miR-9 和miR-125b的表达水平不受性别、年龄和死亡原因的影响。

2.2PMI推断及数学模型验证

对候选RNA指标Ct值进行内参标准化处理并分析其与PMI的相关性。相关系数r分别为：β-actin，0.837 2（P＜0.01）；GAPDH，0.683 1（P＜0.01）；18S rRNA，0.472 5（P＞0.01），RPS29，0.403 6（P＞0.01）；U6 snRNA，0.2036（P＞0.01）。经内参标准化后，人体脑组织中βactin与PMI的相关性最好，GAPDH次之，其余RNA指标与PMI相关性无统计学意义。

运用R v3.2.3软件分别将已知ΔCt值及温度分别代入已建的β-actin、GAPDH模型［2］进行验证，分别得到β-actin和GAPDH的PMI推断值，推断值范围设定为［0，24］，并计算推断PMI与实际PMI的误差率，结果见表3。

对于所有样本，运用β-actin模型推断PMI的总误差率为24.6%，GAPDH为41.0%。对于1～6号案例（PMI实际在0～12h），运用β-actin模型推断PMI的平均误差率为35.2%，GAPDH为48.9%。对于7～12号案例（PMI实际在12～24h），运用β-actin模型推断PMI的平均误差率为14.1%，GAPDH为33.1%。与GAPDH比较，运用β-actin模型推断PMI误差率相对较低。统计发现GAPDH推断PMI的误差率与案例样本的死亡原因有关，失血性休克死亡样本误差率为43.8%，机械性窒息死亡样本误差率为44.5%，两者之间差异无统计学意义（P＞0.01），但均大于颅脑损伤死亡样本误差率（32.0%，P＜0.01）。

表3　利用数学模型推断样本PMI

3　讨　论

PMI的推断一直是法医学领域重要且复杂的课题，其推断方法多种多样，近年来应用实时荧光定量PCR技术测定RNA表达水平推断PMI已成为研究热点［4］。由于人体死亡后不同个体间存在诸如年龄、性别、温度、死亡原因等内外因素的干扰，直接进行人体资料的研究缺乏可行性。在动物实验中，组织易于获取和保存，实验条件（如温度、PMI等）可控，建立的方程可信度较高，因此建立动物模型研究RNA降解变化规律对于人体PMI推断有着重要的参考价值。本课题组在前期研究［2］中已经建立了大鼠脑组织24 h内多温度、多RNA指标的数学模型推断早期PMI，但缺乏人体样本的进一步验证。为了证实该方法的可行性及准确性，本研究收集已知PMI的人体样本，探讨人体脑组织中多种RNA含量与早期PMI的相关性。

为了将人体样本和动物样本数据有效统一，尽可能消除大鼠与人体组织种属差异的影响，本研究所选用的RNA指标均具有良好的保守性与稳定性。βactin和GAPDH是常用的管家基因，广泛存在于所有细胞中，高度稳定保守［5-6］；RPS29属于核糖体蛋白家族，用于编码40S亚基的核糖体蛋白，在不同的细胞系中拥有良好的稳定性，是一类广泛存在的基因［7］；18S rRNA和5S rRNA是核糖体RNA，其突变速率相对恒定，而且进化过程相对缓慢，其保守区常用于构建生命的统一进化树，在不同物种间具有很高的保守性［8］；U6 snRNA是核内小RNA，参与真核生物细胞核中RNA的加工，在一级结构和二级结构上都高度保守［9］；miRNA也是真核生物中广泛存在的小分子RNA，可调节其他基因的表达，并在不同物种间有着较好的连续性和保守型，也常用于研究物种的进化规律［10］。此外，本研究中人体RNA引物设计位置和序列与前期研究大鼠引物尽量一致，其扩增产物片段的大小和序列也尽量保持一致，进一步消除种属差异的影响。

除此之外，实时荧光定量PCR结果的准确性很大程度上取决于内参指标的标准化。选取稳定的内参指标可以排除个体差异带来的误差，使统计结果更加客观、准确。对于人体样本，找到合适的内参指标对于RNA表达水平的准确定量至关重要。经geNorm软件统计分析，5S rRNA、miR-9和miR-125b具有最好的稳定性。为了排除相关参数（如性别、年龄及死亡原因等）对候选RNA表达的影响，本研究还做了进一步的研究，以确定所选的三个内参是否可作为稳定可靠的内参指标应用于PMI推断研究。结果显示三个内参指标的表达水平与上述参数无明显的相关性，表明5S rRNA、miR-9和miR-125b适合作为内参指标，其表达不易受内外因素的影响，在死亡早期脑组织中表达稳定。

筛选出内参指标后，对其余候选RNA指标进行标准化处理，并计算各RNA表达水平与PMI的关系。结果表明β-actin相关系数最高，GAPDH次之，表明这两个指标更易受PMI的影响，与前期研究［2］结果一致。分别将标准化后的β-actin和GAPDH代入相应数学模型，进行PMI推断。结果表明，在12个人体样本中，运用β-actin模型推断PMI的总误差率为24.6%，运用GAPDH模型推断PMI的总误差率为41.0%，分别高于前期研究中动物样本的14.1%和22.2%。对于GAPDH，在进行人体样本PMI推断时其误差率较高，且在失血性休克死亡和机械性窒息死亡样本中误差率明显高于颅脑损伤样本，表明GAPDH可能受死亡原因影响。GAPDH是常用的RNA指标，性质相对稳定保守，但也有研究［11］表明，GAPDH在特定环境中（如缺氧情况下）表达水平发生改变。Koppelkamm等［6］报道GAPDH表达水平在窒息死亡样本中高于颅脑损伤死亡样本。Yamanaka等［12］发现在人皮肤成纤维细胞中，GAPDH在缺氧情况下表达上调而β-actin保持不变。本研究中GAPDH误差率较高可能是由于GAPDH在失血性休克和机械性窒息样本中表达上调，ΔCt值变小，以致误差率升高。对于β-actin，在动物样本和人体样本中其误差率都相对较低，推测是由于其表达水平不受死亡原因的影响，与PMI的相关性更好，表明利用β-actin进行PMI推断相对准确。研究还发现PMI在12～24 h的人体样本推断误差率明显小于PMI在0～12 h的样本，推测是由于随PMI延长RNA降解速率加快，ΔCt增加明显所致。因此，对于更早期的PMI推断还需筛选时序性降解更敏感的RNA指标做进一步研究。

本研究利用实时荧光定量PCR技术研究人体脑组织8种RNA指标在死亡早期的降解规律。实验结果表明5S rRNA、miR-9和miR-125b在人体样本中表达稳定，其表达水平与年龄、性别、死亡原因无关，适合作为PMI推断的内参指标。经内参标准化处理后，分别将β-actin和GAPDH代入前期研究中建立的数学模型进行PMI推断，推断误差率分别为24.6% 和41.0%。GAPDH推断误差率较高，推测是特定RNA表达受死亡原因影响所致。β-actin表达水平与PMI相关性良好，推断误差率也相对较低，证实运用该方法推断人体样本早期PMI相对准确有效。本课题将继续收集人体组织进行大样本验证，以期优化数学模型，提升推断精确度，以符合实际检案的需要。

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（本文编辑：邹冬华）

Correlation between RNA Expression Level and Early PMI in Human Brain Tissue

LÜ Ye-hui1，MA Kai-jun2，LI Zhi-hong1，GU Jun1，BAO Jian-ying1，YANG Zhi-fang1，GAO Jing1，ZENG Yan3，TAO Li3，CHEN Long3
（1.Shanghai University of Medicine&Health Science，Shanghai 201318，China；2.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence，Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China；3.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Science，Fudan University，Shanghai 200032，China）

Objective To explore the correlation between the expression levels of several RNA markers in human brain tissue and early postmortem interval（PMI）.Methods Twelve individuals with known PMI （range from 4.3 to 22.5 h）were selected and total RNA was extracted from brain tissue.Eight commonly used RNA markers were chosen including β-actin，GAPDH，RPS29，18S rRNA，5S rRNA，U6 snRNA，miRNA-9 and miRNA-125b，and the expression levels were detected in brain tissue by realtime fluorescent quantitative PCR.The internal reference markers with stable expression in early PMI were screened using geNorm software and the relationship between its expression level and some relevant factors such as age，gender and cause of death were analyzed.RNA markers normalized by internal reference were inserted into the mathematic model established by previous research for PMI estimation using R software.Model quality was judged by the error rate calculated with estimated PMI.Results 5S rRNA，miRNA-9 and miRNA-125b showed quite stable expression and their expression levels had no relation with age，gender and cause of death.The error rate of estimated PMI using β-actin was 24.6%，while GAPDH was 41.0%.Conclusion 5S rRNA，miRNA-9 and miRNA-125b are suitable as internal reference markers of human brain tissue owing to their stable expression in early PMI.The expression level of βactin correlates well with PMI，which can be used as an additional index for early PMI estimation.

forensic pathology；RNA；brain；postmortem interval；real-time fluorescent quantitative PCR

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.002

1004-5619（2016）04-0245-05

国家自然科学基金面上资助项目（81373242、81671863）；上海健康医学院种子基金项目；上海高校青年教师培养资助计划

吕叶辉（1989—），男，博士研究生，主要从事基础医学及法医学教学、科研工作；E-mail：yeyeliushu@163.com

陈龙，男，博士，主任法医师，副教授，主要从事法医病理学及法医临床学研究；E-mail：chenlong@shmu.edu.cn

2016-03-28）