小鼠主动脉内皮细胞MEF2A RNA干扰对PAI-1表达的影响

周文平

基础研究

小鼠主动脉内皮细胞MEF2A RNA干扰对PAI-1表达的影响

周文平

目的 观察肌细胞增强因子2A（MEF2A）RNA干扰对小鼠主动脉内皮细胞MEF2A表达的影响及纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）表达的影响。方法 构建MEF2A RNA干扰慢病毒和阴性对照慢病毒（NC），并对小鼠主动脉内皮细胞进行慢病毒转染，然后把主动脉内皮细胞分为MEF2A RNAi组、慢病毒阴性对照组（NC组）和对照组，取细胞培养上清液，应用ELISA和逆转录-聚合酶链反应检测MEF2A及PAI-1表达的变化。结果 慢病毒转染MEF2A RNA干扰组PAI-1浓度为（2.45±0.16）ng/ml，病毒转染对照组（NC组）PAI-1浓度为（1.23±0.13）ng/ml，对照组 PAI-1浓度为（1.35±0.10）ng/ml，MEF2A RNA 干扰组与 NC 组、对照组相比，P<0.05；NC组与对照组相比，P＞0.05。MEF2A RNA干扰明显降低MEF2A活性及其mRNA表达，显著促进小鼠主动脉内皮细胞PAI-1的活性及其mRNA表达。结论 慢病毒介导的MEF2A RNA干扰可明显抑制小鼠主动脉内皮细胞MEF2A的表达，并促进血管细胞内PAI-1的高表达。

肌细胞增强因子2A； RNA干扰； 纤溶酶原激活物抑制剂-1

肌细胞增强因子2A（myocyte enhancer factor2A，MEF2A）是目前研究较多的与动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）相关的生物活性物质。肌肉细胞中MEF2A转录因子可与多数肌肉特异性基因调控区富含A/T的序列相结合，调控其靶基因转录，在血管生长发育过程中起重要作用[1]。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种可以高效特异地阻断特定基因的表达基因治疗方法，目前已经广泛地应用于体内外基因功能的研究。本研究应用体外合成 MEF2A短发夹 RNA（small hairpin RNA，shRNA）转染小鼠主动脉内皮细胞，高效特异性地抑制MEF2A的表达，观察MEF2A RNA干扰对MEF2A表达及细胞因子PAI-1表达的影响，为预防AS的发生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 本实验中所用的细胞为小鼠主动脉内皮细胞（mouse aorta：normal aortic endothelial Cells），购自江苏江阴齐氏生物科技有限公司。细胞的培养采用江苏江阴齐氏生物科技有限公司专利产品小鼠主动脉内皮细胞培养试剂盒（Mouse Aorta PrimaCellTM：Normal Aortic Endothelial Cells Cat No.3-4197）来优化目的细胞生长条件，以降低杂细胞的污染，同时保证质量的稳定。

1.2 主要试剂 PBS液：KCl 0.2 g，NaCl 5.0 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO4·5H2O 1.55 g，加蒸馏水至1000 ml溶解，高压蒸汽消毒30 min后4℃保存。

细胞冻存液配制：10%二甲基亚砜（DSMO），50%DMEM培养基（含15%胎牛血清），混合均匀并过滤后备用。

胰蛋白酶溶液：蒸馏水配制，浓度为0.25%，注射滤器过滤除菌。

1.3 实验分组及观察指标 实验共分3组，对照组、慢病毒阴性对照组（negative control，NC组）及MEF2A RNAi组。观察纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）在正常小鼠主动脉内皮细胞组和MEF2A RNAi组的表达。

1.4 上清液MEF2A及PAI-1活性的检测 收集细胞培养上清液，按照MEF2A及PAI-1 ELISA试剂盒说明书分别测定MEF2A及PAI-1活性。

1.5 统计学方法 应用SPSS 15.0统计软件进行单因素方差分析。计量资料以±s表示，多样本均数间的两两比较采用least significant difference（LSD）检验和 Student-Newman-Keuls（SNK）检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PAI-1在对照组、病毒阴性对照组（NC组）和MEF2A RNAi组细胞培养上清液中的表达 在对照组、NC组及MEF2A RNAi组的表达水平有显著差异。MEF2A RNAi组与对照组及NC组均有显著差异。NC组与对照组各指标浓度水平未见统计学差异（P>0.05）。见表 1。

表1 PAI-1在小鼠上清液中的表达（±s）

表1 PAI-1在小鼠上清液中的表达（±s）

注：MEF2A：肌细胞增强因子2A；PAI-1：纤溶酶原激活物抑制剂-1。与对照组比较，aP<0.05；与NC组相比，bP<0.05

组别 例数 PAI-1（ng/ml）对照组 8 1.35±0.10 NC 组 8 1.23±0.13aMEF2A RNAi 8 2.45±0.16ab

2.2 MEF 2A RNAi对纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）基因表达的影响 MEF 2A RNAi对小鼠主动脉内皮细胞PAI-1活性及其mRNA表达的影响：对小鼠主动脉内皮细胞转染NC或MEF 2A RNAi慢病毒载体来观察MEF 2A RNAi对PAI-1基因表达的影响，测定PAI-1活性及其mRNA的表达。NC组与对照组相比，PAI-1浓度及其mRNA表达未见统计学差异，MEF2A RNAi可明显抑制小鼠主动脉内皮细胞MEF2A表达并使PAI-1表达增高（浓度及mRNA表达）。见图1。

图1 PAI-1活性及其mRNA表达

3 讨论

动脉粥样硬化是随着人年龄增长而出现的动脉非炎症性病变，其规律通常是在青少年时期发生，至中老年时期加重、发病，是冠心病及其并发症的潜在原因和病理生理学基础。动脉粥样硬化不仅是一种脂质性疾病，更是一种与炎症有着错综复杂联系的炎症性疾病。炎症在动脉粥样硬化的发病过程中起重要作用，涉及动脉粥样硬化发生发展的各个阶段，并与动脉粥样硬化斑块的形成、进展、破裂、血栓形成及血管成形术后再狭窄等一系列病理生理过程密切相关。因此，早期、正确、积极地诊断和治疗动脉粥样硬化及其并发症具有重要意义。

血管内皮细胞是位于循环血液与血管壁内皮下组织之间的单层细胞，它在动脉粥样硬化形成过程中所起的作用受到越来越多的重视。在各种病因启动下，血管内皮细胞受损，平滑肌细胞增殖形成新生内膜，由此导致内膜增厚，管腔狭窄。在正常内皮修复功能作用下，内皮细胞快速覆盖受损内膜能抑制平滑肌细胞的增殖。在动脉粥样硬化形成的过程中血管壁的病理改变主要有以下三个方面：一是血管壁的内皮细胞出现功能性或器质性改变，内膜通透性增加；二是血液中的脂类物质（如低密度脂蛋白）侵入受损的血管内皮下被氧化修饰，炎症细胞（主要是单核细胞）黏附到血管内皮细胞上，和中膜增殖的平滑肌细胞一起进入内膜下，吞噬已被氧化修饰的血液脂类物质，形成泡沫细胞；三是增殖的平滑肌细胞使血管壁增厚，启动血栓形成机制，迁移到内皮下形成纤维帽。

纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）是纤溶系统的主要抑制因子，可抑制组织型纤溶酶原激活物和尿激酶型纤溶酶原激活物。血管内皮细胞是血浆中PAI-1产生的主要场所，正常情况下内皮细胞分泌的PAI-1减少纤维蛋白降解，引起纤维蛋白聚集，使纤溶系统和抗纤溶系统处在动态平衡中[2]。正常血管中PAI-1分布在内膜和中膜中，PAI-1mRNA主要在平滑肌细胞和巨噬细胞中表达[3]。在动脉粥样硬化血管中PAI-1的表达明显增强，动脉粥样硬化斑块中，PAI-1在坏死细胞核中和斑块周围增厚内膜中的巨噬细胞和平滑肌细胞中表达呈强阳性[4]。斑块破裂时，活化的血小板通过释放PAI-1而使纤溶系统功能削弱，形成凝血系统和纤溶系统之间的失平衡，血栓形成促进了动脉粥样硬化的病理进程[5]。MEF2A属于转录因子肌细胞增强因子2（MEF2）家族中的一员。MEF2A转录因子的N端结构具有MADS盒结构。MADS盒结构存在于多数转录因子家族中，这样的结构可以使蛋白质之间形成二聚体，识别靶DNA并与之结合。MEF2A包含了由29个氨基酸组成的结构域，用来识别靶DNA上的序列结构（-CTA［APT］4TAGPA-）并与之结合，MEF2A蛋白与基因启动子中特定序列结合，从而调节基因的表达。大量实验表明，MEF2A蛋白与血管的完整性和血管内皮细胞的生存有关[6]，有丝分裂原激活蛋白（MAPK）的蛋白激酶ERK5（extracellular-regulatedkinases-5）参与内皮细胞的存活和增殖的信号分子，MEF2-HDAe（histone deacetylase）信号在维持血管的完整性方面的作用[7]。因此，MEF2A在维护血管内皮完整性方面发挥着重要的作用。RNA干扰是生物体生命进程中普遍存在的一种现象，是指内源性或外源性的双链RNA导入细胞后，产生特异性序列的转录后基因沉默，进而抑制靶基因表达的现象。在此过程中，双链RNA通过刺激目标RNA降解而特异性地抑制特定目标蛋白的表达。本研究设计针对MEF2A基因的shRNA慢病毒载体，用它转染小鼠主动脉内皮细胞，采用RNA干扰的方法高效特异性地抑制小鼠主动脉内皮细胞MEF2A的表达，然后观察对MEF2A及相关炎症基因mRNA表达的影响，结果发现，MEF2A RNAi能有效地抑制MEF2A和PAI-1的表达。抑制炎症因子是未来治疗动脉粥样硬化的新途径，基因治疗是未来治疗动脉粥样硬化的新方向。

PAI-1与心血管疾病发生密切相关，PAI-1在AS发病过程中发挥协同作用，促进血管壁的炎症反应及AS的形成和发展，血液中高水平的PAI-1还可以对斑块不稳定、破裂及未来的心血管事件起到预测作用[8]。本实验中，我们设计针对MEF2A基因的shRNA慢病毒载体，用它转染人小鼠主动脉内皮细胞细胞，采用RNA干扰的方法高效特异性地抑制小鼠主动脉内皮细胞MEF2A的表达，然后观察对MEF2A及PAI-1基因mRNA表达的影响，结果发现MEF2A RNAi能有效地抑制MEF2A表达并促进PAI-1的表达。NC组和对照组相比未发现MEF2A及其mRNA表达有任何差别，说明NC慢病毒转染不能降低MEF2A及mRNA表达，也说明MEF2A RNAi的有益作用并不是来源于慢病毒转染所引起的非特异性免疫反应。在本研究中我们发现，MEF2A RNAi促进了小鼠主动脉内皮细胞PAI-1的表达，这对明确MEF2A RNAi与PAI-1和AS形成的关系提供了有力证据。因此，慢病毒介导的MEF2A RNA干扰可以有效降低小鼠主动脉内皮细胞MEF2A活性及mRNA表达，同时促进PAI-1活性及mRNA表达。慢病毒介导的MEF2A RNA干扰及对PAI-1表达的影响，对动脉粥样硬化的发生发展具有明显的促进作用。

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Effect of myocyte enhancer factor 2A RNA interference on expression of PAI-1 in mouse aortic endothelial cells

ZHOU Wen-ping．Department of Cardiovascular Medicine，the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，zhengzhou 450052，China

Objective To observe the effect of MEF2A RNA interference on the expression of MEF2A in mouse aortic endothelial cells，and the effect on the expression of plasminogen activator inhibitor-1 （PAI-1）.Methods The MEF2A RNA interference lentivirus and the negative control of lentivirus（NC）were constructed，and transfected to the mouse aortic endothelial cells.Their silencing efficiency was determined.The changes of MEF 2A and PAI-1 expression levels were detected by ELISA and reverse transcription polymerase chain reaction.Results The concentration of PAI-1 in Lentivirus transfection MEF2A RNA interference group was （2.45±0.16）ng/ml，the concentration of PAI-1 in virus transfection control group（NC group）was（1.23±0.13）ng/ml，the concentration of PAI-1 in control group was（1.35±0.10）ng/ml，MEF2A RNA interference group compared with NC group and the control group，P<0.05，NC group compared with control group，P＞0.05，MEF 2A RNA interference can significantly reduce the MEF2A activity and its mRNA expression，and remarkably increase the activity and mRNA expression of PAI-1 in mouse aortic endothelial cells.Conclusion Lentivirus-mediated RNA interference of MEF 2A can significantly inhibit the expression of MEF 2A and enhance the expression of inflammatory gene PAI-1.

Myocyte enhancer factor 2A； RNA interference； PAI-1

450052 河南省郑州市，郑州大学第三附属医院心内科

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．05．023

Q95-33；R543.1

A

1672-5301（2016）05-0473-04

2015-09-29）