硝酸盐后处理对心肌缺血再灌注损伤过程中内质网应激的影响研究

吴娜 宋达琳 蔡尚郎

基础研究

硝酸盐后处理对心肌缺血再灌注损伤过程中内质网应激的影响研究

吴娜 宋达琳 蔡尚郎

目的 探讨硝酸盐后处理（PPostC）对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中细胞凋亡的影响，以及特异性内质网应激（ERS）损伤相关蛋白Grp78（葡萄糖调节蛋白78）和Caspase 12（半胱氨酸蛋白酶12）的蛋白表达水平的变化和意义。方法 Wistar大鼠24只随机分为假手术组、I/R组（缺血再灌注组）、PPostC组（硝酸盐后处理组）三组，每组8只。分别测定各组大鼠心肌缺血和梗死面积、细胞凋亡指数及Caspase12、Grp78蛋白表达。结果 假手术组未见梗死心肌和缺血心肌，PPostC组心肌缺血区面积和梗死区面积均明显小于 I/R 组［（42.08±4.84）%比（53.31±3.87）%，（38.13±2.05）%比（52.19±3.44）%，P 均<0.01］。假手术组心肌细胞凋亡指数明显低于 I/R 组和 PPostC 组［（6.70±2.25）%比（26.92±1.91）%比（20.54±3.05）%，P均<0.01］。心肌组织Grp78蛋白水平假手术组亦明显低于I/R组和PPostC组，且PPostC组高于I/R组［0.13±0.03比1.04±0.16比1.22±0.11，P均<0.01］；心肌组织Caspase12蛋白表达水平假手术组明显低于I/R组和PPostC组，且PPostC组低于I/R组［0.11±0.01比0.41±0.06比0.33±0.04，P均<0.01］。结论 PPostC能减轻心肌细胞凋亡，而ERS激活参与了大鼠MIRI过程，推测PPostC在大鼠MIRI过程中可能通过调节ERS途径抑制细胞凋亡，改善MIRI。

缺血后处理； 心肌缺血再灌注损伤； 细胞凋亡； 内质网应激

目前我国心肌梗死发病率及死亡率仍居高不下[1]。急性心肌梗死后再灌注治疗能挽救梗死心肌，但某些情况下伴随出现的心肌缺血再灌注损伤（MIRI）也可加重心肌损伤，增加心肌细胞凋亡[2]。既往众多研究证实，缺血后处理（包括药物缺血后处理）能够减轻MIRI，缩小梗死面积[3,4]，可通过多种途径改善细胞凋亡[5,6]。但目前对内质网应激（ERS）介导的细胞凋亡途径是否参与调节的研究较少，Grp78、Caspase-12是ERS诱导细胞凋亡过程中重要的特异性因子。本研究拟通过动物实验观察硝酸盐药物后处理（PPostC）对MIRI中细胞凋亡的影响，同时检测葡萄糖调节蛋白78（Grp78）和半胱氨酸蛋白酶12（Caspase 12）的蛋白表达水平变化，以期探讨硝酸盐药物后处理对MIRI过程中内质网应激的影响及意义。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备及分组

1.1.1 动物模型制备 大鼠麻醉后连接记录Ⅱ导联心电图1 min，采用改良Pferfer MA推管法制备大鼠缺血再灌注模型。

1.1.2 动物模型分组 选取Wistar大鼠24只，随机分为3组，每组8只。①Sham组（假手术组）：LAD（左前降支冠状动脉）下穿线、套管，不结扎，旷置220 min。②I/R组（缺血再灌注组）：结扎LAD 40 min后完全开放LAD，实施再灌注180 min。③PPostC组（硝酸盐药物后处理组）：结扎LAD 40 min后再灌注缺血开始前，将异舒吉按5 mg/kg经颈静脉注入5 min，结扎LAD 40 min，在再灌注开始前，LAD实施再灌注180 min，同时异舒吉按5 mg/kg泵入持续20 min。

1.2 检测指标

1.2.1 心肌梗死面积测定 应用Evan′s blue和TTC双染法测定。正常心肌组织染色呈现蓝色，缺血区呈现砖红色，梗死区显示白色。心脏横切面拍照后，使用Image-Pro I^lus 6.0图像分析软件测定各区域面积，求和计算出所需总面积。其中蓝红白面积和为左心室面积；红白面积和为缺血区面积；白色区面积即梗死面积。缺血区面积百分比（%）=（缺血区总面积/左心室区面积）×100%，心肌梗死面积百分比（%）=（梗死区面积/缺血区总面积）×100%。

1.2.2 心肌细胞凋亡测定 按常规病理组织学方法制备心肌石蜡标本，采用TUNEL法严格按照试剂盒说明进行心肌组织切片细胞凋亡的原位检测。光镜下正常心肌细胞核呈蓝绿色，细胞核呈棕褐色或棕黄色颗粒且具备凋亡细胞形态学特征判定为凋亡细胞。每张切片于凋亡细胞分布区域各取10个高倍视野，计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，并以百分数（%）表示凋亡指数（apoptotic index，AI）。

1.2.3 心肌组织Caspase12、Grp78蛋白表达检测采用免疫印迹法（Western Blotting）测定。I/R组和IPostC组取梗死区心肌组织，假手术组取对应心肌组织，从心肌提取总蛋白，经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、蛋白印记、DAB或ECL显色等步骤，检测Grp78、Caspase12的蛋白表达。应用图像分析仪测定各条带的吸光度值（A值），以RACK1（A值）/β-Actin（A值）的结果作为RACK1蛋白表达的相对含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件包完成数据分析。实验数据以±s表示，组间两两比较采用LSD-t检验，多组间均数比较采用One-Way ANOVA方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 假手术组测定结果 肉眼观察心肌组织呈现蓝色，未见白色梗死心肌和砖红色缺血心肌；细胞凋亡指数明显低于I/R组和PPostC组［（6.70±2.25）%比（26.92±1.91）%比（19.49±2.41）%］，P 均<0.01，t=19.39、10.98。

2.2 手术各组心肌梗死面积和心肌细胞凋亡测定结果比较 I/R组和PPostC组心肌缺血面积分别为（53.31±3.87）%和（42.08±4.84）%，心肌梗死面积分别为（52.19±3.44）%和（38.13±2.05）%。与 I/R 组相比，PPostC组心肌缺血面积和梗死面积均明显减少，P 均<0.05，t=5.13，9.93。I/R 组和 PPostC 组心肌细胞凋亡指数分别为（26.92±1.91）%和（19.49±2.41）%。与I/R组相比，PPostC组心肌细胞凋亡指数明显减少，P<0.01，t=6.84。见表1。

2.3 各组蛋白表达结果 Grp78蛋白表达水平在假手术组心脏相应区域心肌与I/R组和PPostC组梗死灶区心肌分别为（0.13±0.03，1.04±0.16，1.22±0.11），与假手术组相比，I/R组和 PPostC组的Grp78蛋白表达明显升高，P均<0.01，t=-16.25，-27.31；与I/R组相比，PPostC组的Grp78蛋白表达水平增加，P<0.01，t=-2.66。Caspase12蛋白表达水平在假手术组心脏相应区域心肌与I/R组和PPostC组梗死灶区心肌分别为（0.11±0.03，0.46±0.71，0.40±0.06）。I/R组和 PPostC 组的 Caspase12 蛋白表达水平与假手术组相比明显增加，P均<0.01，t=-14.16，-12.98；与I/R组相比，PPostC组的Caspase12蛋白表达水平降低，P<0.01，t=3.19。见表2、图1。

表1 I/R组和PPostC组心肌梗死面积及心肌细胞凋亡指数比较（±s）

表1 I/R组和PPostC组心肌梗死面积及心肌细胞凋亡指数比较（±s）

注：I/R：缺血再灌注，PPostC：硝酸盐后处理。与I/R组相比，aP<0.01

凋亡指数（%）I/R 组 8 53.31±3.87 52.19±3.44 26.92±1.91 PPostC 组 8 42.08±4.84a38.13±2.05a19.49±2.41a组别 例数 缺血区面积（%）梗死区面积（%）

表2 各组心肌组织Grp78蛋白和Caspase12蛋白表达水平的比较（±s）

表2 各组心肌组织Grp78蛋白和Caspase12蛋白表达水平的比较（±s）

注：I/R：缺血再灌注，PPostC：硝酸盐药物后处理。与假手术组比较，aP<0.01；与I/R组比较，bP<0.01

组别 例数 Grp78蛋白 Caspase12蛋白假手术组 8 0.13±0.03 0.11±0.01 I/R 组 8 1.04±0.16a0.41±0.06aPPostC 组 8 1.22±0.11ab0.33±0.04ab

图1 免疫印迹检测Grp78蛋白和Caspase12蛋白表达

3 讨论

2003年Zhao等[3]在犬在体缺血再灌模型中首次发现缺血后处理能缩小心肌梗死面积。Chiari等[7]在兔在体缺血/再灌模型中证实给予异氟烷药物后处理能产生和缺血后处理同样的心肌保护作用。2005年，法国学者Staat等[6]率先在临床上证实了缺血后处理的心肌保护作用。此后动物实验研究显示，在再灌注时给予腺苷、麻醉药、曲美他嗪、左西孟旦等均可以通过不同机制改善MIRI[8]。本研究结果同样显示PPostC组的缺血区面积和梗死区面积均明显小于I/R组（P均<0.01），证实了PPostC能改善MIRI。并且PPostC组的心肌细胞凋亡指数低于I/R组（P均<0.05），显示PPostC能减轻MIRI过程中的心肌细胞凋亡。

Kunapuli等[9]的研究显示，缺血后处理可在减轻心肌酶释放的同时，通过死亡受体途径和线粒体途径激活有效减轻心肌细胞凋亡。与其不同，ERS介导的细胞凋亡途径是通过激活下游凋亡因子引发细胞凋亡。既往研究显示，在心肌缺血再灌注时存在ERS激活现象[10]。Grp78是ERS反应的一种特异性细胞保护性蛋白，当机体发生缺氧、低血钙等应激时，Grp78蛋白表达明显增加，可以修复蛋白的组成以维持内质网的稳态，保护细胞[11]。Grall等[12]的研究结果显示，在大鼠缺血再灌注损伤模型中，缺血后处理组Grp78和ATF-6蛋白的表达增加，通过增强ERS减轻MIRI。Caspase-12在介导ERS凋亡途径过程中作为一种促细胞凋亡性蛋白酶具有特异性作用[13]。被激活的Caspase-12可以转运到胞浆中直接或间接激活效应Caspase-3引起细胞凋亡[14]。Liu等[15]对乳鼠心肌细胞进行研究发现，缺血缺氧后处理能够通过减少钙调蛋白和Caspase 12活性抑制ERS，保护缺血再灌注损伤心肌。本研究结果显示，I/R组和PPostC组心肌组织Caspase-12蛋白表达和Grp78蛋白表达水平均明显高于假手术组，从动物实验证实ERS激活参与了大鼠MIRI过程。同时结果显示，PPostC组Caspase-12蛋白表达低于I/R组（P<0.05），而Grp78蛋白表达水平IPostC组明显高于I/R组（P<0.05）。从而推测，缺血后处理可能通过下调Caspase-12蛋白表达减少ERS反应，同时通过上调Grp78蛋白表达，修复蛋白以维持内质网的稳态，从而减少ERS反应，减少心肌细胞凋亡，减轻MIRI。

MIRI是多因子多通路共同作用的结果。本研究结果从动物实验初步证实ERS激活参与了大鼠MIRI过程，并且通过结果推测缺血后处理在大鼠MIRI过程中可能通过减少心肌组织促细胞凋亡性蛋白酶Caspase-12表达和增加细胞保护性蛋白Grp78表达，从而调节ERS途径抑制细胞凋亡，保护缺血再灌注心肌。但具体机制仍有待进一步的实验阐明。

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Effect of nitrates postconditioning on the endoplasmic reticulum stress during the period of myocardial ischemia-reperfusion injury

WU Na＊，SONG Da-lin，CAI Shang-lang．＊Cardiac Medicine Department，the Affiliated Hospital of Qingdao U-niversity，Qingdao 266001，China

Objective To investigate the effects and mechanisms of nitrates ischemic postconditioning（PPostC）on the myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI）model of rat，and investigate whether the endoplasmic reticulum stress（ERS）can influence MIRI.Methods Wistar rats were randomized into three groups（n=8）：sham operation group（sham group），ischemia-reperfusion group（I/R group），nitrates ischemia postconditioning group（PPostC group）.Relative markers which include Ischemic size and infarct size of myocardium，cardiomyocyte apoptosis，Caspase12 and Grp78 protein expression were measured respectively in every group.Results There were no infarct and ischemic myocardium in sham group.Compared with I/R group，PPostC significantly decreased the myocardial ischemic area，myocardial infarct size，and cardiomyocyte apoptosis（P<0.01）.Compared with sham group，the Caspase12 and Grp78 protein expressions in I/R and PPostC groups significantly increased（P<0.05）.Compared with I/R group，the Caspase12 protein expression in PPostC group significantly decreased（P<0.01），while Grp78 protein expression in PPostC group significantly increased （P<0.01）.Conclusion PPostC can reduce the myocardial ischemia-reperfusion injury via decreasing the myocardial ischemic and infarct size，and cardiomyocyte apoptosis.Nitrates ischemic postconditioning can decrease cardiomyocyte apoptosis via low-er the regulation ERS.

Ischemic postconditioning； Myocardial ischemia-reperfusionon injury； Apoptosis； Endoplasmic reticulum stress

CAI Shang-lang，E-mail：caishl@126．com

中国医师协会探索心血管研究基金（项目编号：DFCMDA201303）

266001 山东省青岛市，青岛大学医学院附属市立医院心内科（吴娜），老年内科（宋达琳）；青岛大学医学院附属医院心内科（蔡尚郎）

蔡尚郎，E-mail：caishl@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．05．022

Q95-33；R542

A

1672-5301（2016）05-0470-04

2016-02-17）