心脏不停跳二尖瓣置换术对心肌内质网应激相关因子表达影响的研究及意义

马宪鲁 郑宝石 冯旭 谢晓勇 黄柳柳 罗程

心脏不停跳二尖瓣置换术对心肌内质网应激相关因子表达影响的研究及意义

马宪鲁 郑宝石 冯旭 谢晓勇 黄柳柳 罗程

目的 探讨心脏不停跳二尖瓣置换术（MVR）对内质网应激（ERS）相关因子GRP78/Caspase-12在心肌表达的影响及对心肌保护的意义。方法 选取择期行MVR的风湿性心脏病（RHD）二尖瓣狭窄（MS）患者40例，随机分为心脏不停跳组（BH组，n=20）和心脏停跳组（CA组，n=20），分别于体外循环（CPB）转流开始前（T0）、主动脉阻断30 min后（BH组为CPB开始后30 min，T1）及缝合右心房前（T2）收集右心房心肌组织，通过rt-PCR法检测两组心肌GRP78和Caspase-12的表达，同时采用免疫组织化学法检测两组心肌GRP78和Caspase-12阳性着色情况。结果 两组GRP78mRNA表达：CA组T0为0.088±0.009、T1为0.193±0.024、T2为 0.516±0.037，BH 组 T0为 0.085±0.008、T1为 0.189±0.022、T2为 0.229±0.038，两组 GRP78mRNA 在T1时段表达量均增高（P＜0.05），在T2时段表达量增高且CA组表达量高于BH组（P＜0.05）。两组Caspase-12 mRNA 表达：CA 组 T0为 0.205±0.037、T1为 0.341±0.032、T2为 0.912±0.051，BH 组 T0为 0.198±0.035、T1为0.209±0.035、T2为 0.307±0.063，CA 组 Caspase-12 mRNA 的表达量在 T1、T2时段均增高（P＜0.05），BH 组仅在T2时段表达增高（P＜0.05）；CA 组在 T1、T2时间段 Caspase-12 mRNA 表达量均高于 BH 组（P＜0.05）。T2时段CA组与BH组GRP78蛋白免疫组化染色结果为62.74±8.12和35.59±4.09，CA组高于BH组（P＜0.05）；T2时段CA组与BH组Caspase-12蛋白免疫组化染色为69.60±5.54和26.48±2.29，CA组高于BH组（P＜0.05）。结论 心脏不停跳MVR能够通过减轻心肌ERS反应，提高手术过程中的心肌保护作用。

内质网应激；心脏不停跳；天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶12；葡萄糖调节蛋白78；心肌保护

体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）心脏停跳手术对术后心功能影响的主要因素是心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），主要表现为心肌细胞凋亡[1]。如何减轻MIRI过程引起的心肌细胞凋亡一直是心肌保护研究的工作重点。心肌缺血缺氧能够引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS 是除了线粒体调控通路和配体蛋白直接信号调控通路的一种新的细胞凋亡信号通路，过度的ERS能够加重MIRI引起的心肌损伤[2]。研究表明，葡萄糖调节蛋白 78（glucose-regulated protein，GRP78）是 ERS反应的敏感标记物[3]，而天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶12（Caspase-12）是ERS反应中特有的蛋白[4]。目前有关ERS相关因子与心肌细胞凋亡的研究主要集中在动物实验阶段，临床报道较少。本研究通过检测ERS相关因子GRP78和Caspase-12在两种二尖瓣置换手术患者的表达，探讨心脏不停跳术式能否通过减轻ERS来提高心肌保护。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取济宁市第一人民医院心外科2015年9月至2016年3月心脏外科收治的风湿性心脏病（RHD）/二尖瓣狭窄（MS）择期行二尖瓣置换术（MVR）的患者40例，男性 22例，女性18例，年龄（44.7±6.2）岁，体质量（55.1±6.7）kg，心胸比例（0.64±0.05），血压（122.7±9.4/66.5±5.7）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。根据手术方式不同分为心脏停跳组（n=20，CA组）及心脏不停跳组（n=20，BH组）。CA组男性11例，女性9例；BH组男性11例，女性9例。所有患者术前均无冠脉相关疾病、重度心功能不全、甲状腺功能亢进、糖尿病、高血压、主动脉瓣狭窄及关闭不全、重要脏器功能不全，近1个月未服用可能对本次研究结果造成影响的药物。两组患者年龄、体质量、血压、心胸比例、二尖瓣瓣口面积（MVA）、二尖瓣跨瓣压差（MVP）、左室舒张末容积（LVEDV）比较未见统计学差异。

1.2 手术方法 两组患者均采用胸前正中切口入路，纵劈胸骨打开并悬吊心包后显露术野，主动脉、上下腔静脉及左心房插管后开始CPB转流。BH组：CPB并循环降温至鼻咽温度为32℃左右，收紧上、下腔静脉阻断带，但不阻断升主动脉，使心肌始终有温氧合血灌注，CPB过程中平均动脉压保持在60 mm Hg以上，鼻咽温维持在（32.0±0.5）℃，转流中灌注流量控制在（30.0±0.2）L·min-1·m-2，不灌注心脏停跳液，使心脏在缓慢空跳40～60次/min状态下通过右心房-房间隔途径进行MVR。CA组：阻断升主动脉后主动脉根部顺行灌注温血（37℃）停搏液和晶体停搏液按4∶1比例混合的改良St.ThomasⅡ停跳液，心包腔内置入冰屑使心肌表面温度降低，心脏停跳后通过右心房-房间隔途径行MVR。

1.3 标本数据采集 分别于打开右心房时（T0）、主动脉阻断后30 min时（BH组取CPB开始30 min，T1）、缝合右心房时（T2）采集右心房心肌组织，去除血液、脂肪，生理盐水冲洗。修剪心肌组织，大小约2 mm×2 mm×2 mm，置入含有RNAstore液的冻存管中，放置-80℃冰箱中保存用以提取RNA。修剪右心房心肌组织，大小约4 mm×4 mm×4 mm，置入含有4%甲醛液的试管中密封常温保存，24 h后进行脱水、石蜡包埋、切片后用以免疫组织化学染色。该研究方案符合《赫尔辛基宣言》所申明的原则和条款，并得到我院伦理委员会的批准与备案，家属均签订知情同意书。

1.4 心肌Caspase-12和GRP78mRNA表达检测称取心肌组织30 mg提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，OD260/OD280比值在1.75～2.00范围内的RNA样品为合格样品。应用逆转录聚合酶链式反应测定Caspase-12和GRP78mRNA表达，从NCBI GenBank数据库中下载人Caspase-12、GRP78和β-Action基因序列。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物系列如下Caspase-12：F5′-ACAAGCTGGTCCACTGAGAG-3′，R5′-ACCAGAACACCGTTGGATGG-3′；GRP78：F5′-ACTCCTGAAGGGGAACGTCT-3’，R5′-CCACCTTGAACGGCAAGAAC-3′；β -Action：F5′-CAGGCACCAGGGCGTGAT-3′，R5′-TAGCAACGTACATGGCTGGG-3′。依照试剂盒指示建立反应体系，β-Action作为内参照基因分别将β-Action与Caspase-12和GRP78在同一反应体系内进行扩增。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40个循环。β-Action与Caspase-3基因产物长度分别为293 bp与181 bp，反应结束后，按仪器默认条件收集荧光，把离心管迅速放入PCR扩增仪，按扩增程序进行PCR扩增，收集扩增曲线及熔解曲线。见图1。

1.5 心肌Caspase-12和GRP78免疫组化阳性染色 参照Caspase-12和GRP78的中衫金桥PV9000试剂盒进行：60度烤片1 h，二甲苯与梯度乙醇脱蜡与水化后蒸馏水冲洗，微波炉最小火10 min进行抗原修复，3%过氧化氢处理10 min除去内源性过氧化物酶，1∶50～1∶200 一抗 4 ℃孵育过夜，加入试剂1后室温孵育25 min，加入试剂2后室温孵育25 min，每步骤结束后PBS缓冲液洗片3 min×3次。二氨基联苯胺（DAB）显色剂染色5 min，自来水冲洗10 min，苏木素复染5 min，自来水冲洗10 min，梯度乙醇脱水后透明，中性树脂封片。使用光学显微镜分别观察两组心肌细胞Caspase-12和GRP78的表达情况。40高倍光学显微镜观察，随机选取5个不重叠的视野，分别计数阳性着色细胞。Caspase-12染色镜下细胞核为紫蓝色，细胞质内质网阳性染色棕褐色。见图2。

1.6 统计学方法 本研究采用SPSS 17.0统计学软件处理实验数据。计量资料以±s表示，两组间比较采用独立相关t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组手术结果及相关资料比较 两组患者术后均痊愈出院。术后无低心排综合征、肺部感染、重要脏器功能不全、抗凝过度、再次开胸手术等严重并发症。

2.2 心肌Caspase-12和GRP78 mRNA表达结果

Caspase-12 mRNA表达：CA组 Caspase-12 mRNA的表达量在T1时段开始增高，在T2时段显著增高（P＜0.05），BH 组仅在 T2时段表达增高（P＜0.05）；CA 组在 T1、T2时间段 Caspase-12 mRNA 表达量均高于BH组（P＜0.05）。GRP78 mRNA表达：两组GRP78 mRNA的表达量在T1时段都有所增高，在T2时段CA组GRP78 mRNA增高的表达量高于BH组（P＜0.05）。见表1。

2.3 心肌Caspase-12和GRP78免疫组化染色结果 分别观察两组心肌细胞Caspase-12和GRP78的表达情况：两组Caspase-12在T2时阳性着色数均较T0时增高（P＜0.05），CA组在T2时阳性着色数明显高于BH组（P＜0.05）；两组GRP78在 T2时阳性着色数均较T0时增高（P＜0.05），CA组在T2时阳性着色数明显高于BH组（P＜0.05）。见表2、图2。

表1 两组Caspase-12和GRP78 mRNA在不同时间段表达（±s）

表1 两组Caspase-12和GRP78 mRNA在不同时间段表达（±s）

注：Caspase-12：天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶 12；GRP78：葡萄糖调节蛋白 78。与T0比较，aP＜0.05；与 T1比较，bP＜0.05；与CA组比较，cP＜0.05

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表 2 Caspase-12、GRP78 的阳性表达结果（±s）

表 2 Caspase-12、GRP78 的阳性表达结果（±s）

注：Caspase-12：天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶12；GRP78：葡萄糖调节蛋白 78。与 T0比较，aP＜0.05；与 CA 组比较，bP＜0.05

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3 讨论

CPB下心脏停跳手术对于心肌的影响主要是MIRI后的心肌细胞凋亡。为减少上述情况的发生，加强术中心肌的保护主要是采用浅低温（32℃～35℃）下心脏跳动中进行心内直视手术[5]。该方式在术中通过降低心率，保证冠状动脉对心肌的持续血液供应，维持心肌细胞内环境的稳定，在一定程度上避免了MIRI。由于心肌细胞具有高能量代谢特点，决定了在阻断主动脉心脏停跳后的缺血、缺氧导致心肌细胞ATP与营养物质快速消耗后不能及时补充，出现能量代谢障碍诱发ERS[6]。在开放主动脉，心脏恢复血供，心肌出现血液再灌注后，心肌细胞产生大量氧自由基、Ca2+超负荷等又加重了ERS[7]。ERS发生激活了高度保守的未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），该反应能够提高内质网加工及重新折叠蛋白质的能力，同时清除内质网中的受损伤蛋白，维持细胞的内环境稳态[8]。

葡萄糖调节蛋白78（GRP78）又称免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP），作为内质网调节性分子伴侣蛋白，是ERS的经典标志物[9]。在ERS时GRP78可通过与内质网激酶（PERK）、肌醇依赖酶-1（IRE1）及转录激活因子6（ATF6）这三种内质网跨膜蛋白所介导的UPR结合[10]。过多的错误折叠和未折叠蛋白在内质网中异常聚集时，会诱发GRP78表达，从而激活PERK、IRE1、ATF6的表达。前者与内质网中错误折叠和未折叠的蛋白结合，恢复蛋白质正确构象；后者抑制ERS反应[11]。本研究中两组GRP78在T1时段表达量都有增高，说明CPB开始时由于心肌缺血缺氧以及炎性介质的产生等因素诱发ERS；在T2时段BH组GRP78表达增加较CA组低，说明心脏不停跳状态下ERS强度平稳，维持在轻度应激水平；而CA组GRP78表达量显著增高，说明心脏停跳下心肌缺血、缺氧以及恢复血供后再灌注等导致过强的ERS反应，加重心肌损伤。

天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶12（Caspase-12）作为凋亡蛋白酶（Caspase）家族成员之一，也是ERS的经典标志物[9]。ERS反应介导细胞凋亡的最终执行者是Caspase蛋白酶，而特征性Caspase-12仅存在于内质网中，ERS时GRP78与无活性的前体Caspase-12（pro-Caspase-12）结合，过度 ERS 时导致该复合物裂解，释放活性的Caspase-12[12]。Caspase-12在ERS是表达量增高激活同族成员Caspase-9后间接或者直接激活同族成员Caspase-3表达介导细胞凋亡[13]。朱汉华等[14]在大鼠实验时发现，冠脉微栓塞心肌缺血后心肌细胞凋亡中Caspase-12表达水平升高，并参与了心肌细胞凋亡。本研究发现，CA组Caspase-12表达量在T1时段即有升高，在T2时段显著升高，说明在心肌缺血缺氧时即发生ERS，同时在MIRI过程中通过ERS途径激活参与心肌细胞凋亡。BH组中Caspase-12仅在T2时表达增高，且较CA组相应时段低，说明心脏不停跳术式可以减轻ERS在MIRI中介导心肌细胞凋亡。

图1 Caspase-12与GRP78扩增与熔解曲线

图2 两组T2时间段免疫组化法Caspase-12和GRP78染色结果（×400）

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Study the myocardial expression of GRP78/Caspase-12 in beating heart mitral valve replacement

MA Xian-lu＊，ZHENG Bao-shi，FENG Xu，et al.＊Department of Cardiac Surgery，Jining NO.1 People′s Hospital，Jining 272011，China

ZHENG Bao-shi，E-mail：zhengbs25@vip.sina.com

Objective To observe the influence about the expression of related factors GRP78/Caspase-12 about endoplasmic reticulum stress（ERS） in beating heart mitral valve replacement and study the significance of myocardial protection.Methods 40 patients with rheumatic heart disease mitral stenosis were randomly divided into beating heart group（BH，n=20）and cardiac arrest group（CA，n=20），both of them were accepted MVR by beating heart surgery and cardiac arrest surgery under cardiopulmonary bypass（CPB）respectively.Right atrial myocardial tissue were collected at prior the start of CPB （T0），after aortic cross-clamping 30 minutes（BH group in the beginning 30 minutes after CPB，T1）and stitched right atrium （T2）respectively.Using the method of reverse transcriptase polymerase chain reaction（rt-PCR）detection the expression level of GRP78 and Caspase-12 in two groups.Observing the myocardial tissue slices positive expression about GRP78 and Caspase-12 by immunohistochemical.Results The expression of GRP78 in two groups：CA group T0（0.088±0.019），T1（0.223±0.024），T2（0.516±0.037）；BH group T0（0.085±0.022），T1（0.189±0.022），T2（0.259±0.038）.The expression of GRP78 had increased at T1in two groups（P＜0.05），CA group expressed higher than the BH group at T2（P＜0.05）.The expression of Caspase-12 in two groups：CA group T0（0.202±0.033），T1（0.361±0.042），T2（0.852±0.051）；BH group T0（0.198±0.034），T1（0.211±0.030），T2（0.327±0.053）.Caspase-12 in CA group expressed heighten at T1and T2（P＜0.05），Caspase-12 in BH group had increased in T2only（P＜0.05）.Caspase-12 in CA group expressed higher than the BH group at T1and T2（P＜0.05）.The staining results of immunohistochemical about GRP78 in CA and BH at T2were（62.74±8.12）and（35.59±4.09），CA group higher than BH（P＜0.05）.The results of Caspase-12 in CA and BH at T2were（69.60±5.54）and（26.48±2.29），CA group higher than BH（P＜0.05）.Conclusion MVR of beating heart can reduce the reaction of ERS to enhance the myocardial protection under CPB.

Endoplasmic reticulum stress；Beating heart surgery；Caspase-12；GRP78；Myocardial protection

广西科学研究与技术开发计划项目（项目编号：桂科攻1355005-2-3）；广西自然科学基金项目（项目编号：2013GXNSFAA192052）

272011 山东省济宁市，济宁市第一人民医院心外科（马宪鲁、张申、周成运）；广西医科大学第一附属医院心脏外科（郑宝石、冯旭、谢晓勇）

郑宝石，E-mail:zhengbs25@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.12.019

R654.2

A

1672-5301（2016）12-1123-04

2016-05-26）